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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 存档旧帖 » DNA序列产物
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bbwalkman

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+5, MolEPI+1, 很热心哦，鼓励正确解答问题 2012-06-13 17:18:26
yuancying: 金币+20, ★★★★★最佳答案, 非常感谢 2012-06-13 19:30:13
1.RNA提取：一般RNA提取的话，选择的是TRizol试剂，这个在Invitrogen就能买到，然后依次用氯仿，异丙醇和75％乙醇进行处理，然后紫外定量，进行保存。
2.cDNA制备：一般的cDNA第一条链的制备都是利用反转录酶和oligo dT进行实现的，通过oligo dT和你RNA poly（A）尾巴进行结合，然后在反转录酶（M-mlv还可以）进行第一条链的制备。
3.引物设计：根据你序列的长短，通过oligo 6和Premier primer 5两个软件进行设计。
4.PCR扩增：这就是普通的PCR扩增了，如果你的PCR序列比较长的话，建议你选取高保真的聚合酶，可以减少错配，另外，退火温度和循环数做几次实验就能摸索出来了。
5.琼脂糖凝胶电泳：这就是看你目的片段，选好胶的浓度，上样电泳就ok了，然后凝胶成像看看有没有条带就好了。
6.DNA切胶回收：一般都是有试剂盒的，可以按照试剂盒进行操作。
PS：这个扩增出来的DNA是通过mRNA为模板扩增出来的，应该是不包括原有DNA序列中内含子序列的，不知道你能不能用，祝好运！
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2楼2012-06-13 15:36:02
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