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bbwalkman

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+5, MolEPI+1, 很热心哦,鼓励正确解答问题 2012-06-13 17:18:26
yuancying: 金币+20, ★★★★★最佳答案, 非常感谢 2012-06-13 19:30:13
1.RNA提取:一般RNA提取的话,选择的是TRizol试剂,这个在Invitrogen就能买到,然后依次用氯仿,异丙醇和75%乙醇进行处理,然后紫外定量,进行保存。
2.cDNA制备:一般的cDNA第一条链的制备都是利用反转录酶和oligo dT进行实现的,通过oligo dT和你RNA poly(A)尾巴进行结合,然后在反转录酶(M-mlv还可以)进行第一条链的制备。
3.引物设计:根据你序列的长短,通过oligo 6和Premier primer 5两个软件进行设计。
4.PCR扩增:这就是普通的PCR扩增了,如果你的PCR序列比较长的话,建议你选取高保真的聚合酶,可以减少错配,另外,退火温度和循环数做几次实验就能摸索出来了。
5.琼脂糖凝胶电泳:这就是看你目的片段,选好胶的浓度,上样电泳就ok了,然后凝胶成像看看有没有条带就好了。
6.DNA切胶回收:一般都是有试剂盒的,可以按照试剂盒进行操作。
PS:这个扩增出来的DNA是通过mRNA为模板扩增出来的,应该是不包括原有DNA序列中内含子序列的,不知道你能不能用,祝好运!
2楼2012-06-13 15:36:02
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