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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » dna切胶回收中各试剂的作用
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冰糖芦荟

金虫 (正式写手)

[求助] dna切胶回收中各试剂的作用

dna切胶回收中各试有时要加异丙醇，他的作用是什么啊？
今天加完之后出现了絮状沉淀是怎么回事？
还有为什么每次本来酶切以后跑胶都有很清楚的条带，切胶回收后基本上没有目的条带了，有时侯有一点但很微弱，一但做连接还是失败。
请教各位帮我解决一下吧！！
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有交流才有成果，好的东西只有得到分享才发挥了它的作用
1楼 2012-05-31 20:44:59
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caoluoyuan

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+1, 鼓励交流 2012-06-04 18:55:52
异丙醇是为了增强DNA和柱子的吸附，增加DNA回收率，回收柱可以重复洗2次，洗脱液加热也可以增加回收率。
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2楼2012-05-31 21:10:39
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mlanqiang

木虫之王 (文学泰斗)

蓝博士

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
回收柱多洗几次看看吧。
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蓝精灵
3楼2012-05-31 21:19:34
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冰糖芦荟

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by caoluoyuan at 2012-05-31 21:10:39
异丙醇是为了增强DNA和柱子的吸附，增加DNA回收率，回收柱可以重复洗2次，洗脱液加热也可以增加回收率。

这些我都做了呀，可是每次回收完跑电泳结果特别暗，有时候会完全消失，到底是怎么一回事儿呢
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4楼2012-05-31 21:23:42
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冰糖芦荟

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by mlanqiang at 2012-05-31 21:19:34
回收柱多洗几次看看吧。

每次都上两遍柱子，而且时间也挺长的，可是每次回收完跑电泳结果特别暗，有时候会完全消失，到底是怎么一回事儿呢
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5楼2012-05-31 21:24:15
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淘气维尼89

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+2, 鼓励交流 2012-06-04 18:56:55
我今天刚做完胶回收，条带很清晰。用胶回收的DNA来做PCR，然后再次胶回收这样浓度就会很高，不过很浪费时间。我觉得关键是PCR做完后要多点样，切胶时尽量做短时间内切出亮度比较集中的目的胶，没有亮度的尽量切掉不要，这样回收时的浓度会高点，回收时可以多次上柱，Elution buffer预热到60度回收的效率比较高
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6楼2012-06-02 17:45:08
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叶伟伟99

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+3, Good！ 2012-06-04 18:56:19
片段小于500bp才加异丙醇的，是为了小片段更好的结合在吸附柱上，回收效率高点。片段大于3000是加水，后面的洗脱效率高
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7楼2012-06-02 18:43:52
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冰糖芦荟

金虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 淘气维尼89 at 2012-06-02 17:45:08
我今天刚做完胶回收，条带很清晰。用胶回收的DNA来做PCR，然后再次胶回收这样浓度就会很高，不过很浪费时间。我觉得关键是PCR做完后要多点样，切胶时尽量做短时间内切出亮度比较集中的目的胶，没有亮度的尽量切掉不 ...

谢谢！！
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有交流才有成果，好的东西只有得到分享才发挥了它的作用
8楼2012-06-02 23:05:38
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冰糖芦荟

金虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 叶伟伟99 at 2012-06-02 18:43:52
片段小于500bp才加异丙醇的，是为了小片段更好的结合在吸附柱上，回收效率高点。片段大于3000是加水，后面的洗脱效率高

谢谢
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9楼2012-06-02 23:07:08
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longrna

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
西瓜: 金币+2, 鼓励交流 2012-06-04 18:56:41
有些公司的kit也没有加异丙醇的。
加异丙醇可以在一定程度上增加结合效率。

另外，所说的切胶前很亮，回收后再跑很弱，要看回收后上样多少？
一般胶回收kit的回收效率一般在40-60%   如点100ng的DNA电泳，经过切胶回收后大约只有40ng左右。
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伟大航线....
10楼2012-06-04 16:39:56
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