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金虫 (小有名气)

[求助] 今天你纯化蛋白了吗?跪求柱子挂不好的原因。。。。 已有1人参与

最近纯化蛋白,各种柱子搞得晚上睡觉都在过柱子。。。。做过纯化的童鞋,你们懂的。。。。。。
但是最近结果总不理想,我将样品脱盐后过Hitrap Q FF柱,穿透(前两个收集管中)中有时会有酶活,然后在第7、8、9管(盐浓度是14%左右)中我的蛋白就洗下来了,这种状况让我真的有点无能为力了。都不知道是何原因,该如何改进,我升高过pH,也挂不住。
我的缓冲液:20mM tris-hcl, 2MNacl+20mMtris-hcl.
希望各位纯化专家能给我解答一下,谢谢。。。。
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永远不要为失去的感到遗憾——你没有摘到的,只是春天的一朵花,整个春天还是你的。
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金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by sunsicheng at 2012-05-31 10:29:25
加油...

谢谢
永远不要为失去的感到遗憾——你没有摘到的,只是春天的一朵花,整个春天还是你的。
3楼2012-05-31 10:41:28
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zxc6884

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
zhang8826857: 金币+3, 欢迎来微生物板块交流哦^_^ 2012-06-02 10:40:57
你样品是什么成分?细胞破碎液?硫酸铵沉淀脱盐后?还是其它?
可能是过载了,不一定是你的蛋白过载,而是其它物质结合比你蛋白结合强,导致你的样品挂柱很少。
可以试下SP、或CM阳离子交换。或者高盐条件下去过疏水柱
关注我关注的
4楼2012-06-01 19:10:50
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金虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by zxc6884 at 2012-06-01 19:10:50
你样品是什么成分?细胞破碎液?硫酸铵沉淀脱盐后?还是其它?
可能是过载了,不一定是你的蛋白过载,而是其它物质结合比你蛋白结合强,导致你的样品挂柱很少。
可以试下SP、或CM阳离子交换。或者高盐条件下去过疏 ...

纤维素酶粗酶液,经硫铵沉淀后脱盐的样品上柱。试过SP挂不上,无限郁闷中。
永远不要为失去的感到遗憾——你没有摘到的,只是春天的一朵花,整个春天还是你的。
5楼2012-06-01 19:30:55
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zxc6884

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
zhang8826857: 金币+2, 欢迎来微生物板块交流哦^_^ 2012-06-02 10:41:05
引用回帖:
5楼: Originally posted by 分子结构 at 2012-06-01 19:30:55
纤维素酶粗酶液,经硫铵沉淀后脱盐的样品上柱。试过SP挂不上,无限郁闷中。...

硫酸铵脱盐后有没有用氯化钡鉴定盐是否去除完全?这个酶的pH是多少?挂柱条件是什么?

如果是天然筛选的菌,这种酶有很多同工酶,有时pI值相差较大,是会出现一部分挂上,一部分没挂上。

离子交换条件很重要,有时相差一点,效果也会相差很多。

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6楼2012-06-01 23:28:01
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