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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 想获得较大量的pBR322，却怎么也提不出来，各位大侠帮帮忙……
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Janual

银虫 (小有名气)

[求助] 想获得较大量的pBR322，却怎么也提不出来，各位大侠帮帮忙……

我把质粒转入大肠杆菌，然后摇床扩增，按照分子生物学克隆指南的中提步骤做，加入异丙醇后，离心，有沉淀，而且不少，乙醇洗，开始还有沉淀，但是等它挥发干的时候，沉淀好像不见了。就算沉淀还在，电泳后，也没有条带。很悲剧啊，重复了两次了。这是为什么呢？平板含有氨苄，试管扩增时也有氨苄，三角瓶扩增时也加了氨苄，菌液浓度比较好。跟我之前用小提试剂盒提时养的菌是一样的
为什么提不出来？
各位大侠，我要怎么样才能获得较大量的质粒呢？万分感激！！！
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Janual

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1楼 2012-05-30 00:26:56
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Janual

银虫 (小有名气)
送鲜花一朵
2楼2012-05-30 09:48:04
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XOooZzz

银虫 (小有名气)
用乙醇洗时刚开始有沉淀，后来没有了？？干燥后的DNA应该像一小块保鲜膜一样贴在离心管底部。溶解后的DNA溶液明显比水粘稠。
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Janual
3楼2012-05-30 10:22:22
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早冰124

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-05-30 13:43:12
我们提质粒都是用试剂盒的，一般要获取大量的质粒会增大裂解液buffer p1的用量，裂解时间也稍稍长些，3-4min, 后面的中和反应液也相对加大，即buffer p1 到buffer p3都相应的加大量，当然这前提是你菌体要养的足够多。现在也有质粒小题中量提取试剂盒，可以试试
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Janual
4楼2012-05-30 11:05:05
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Janual

银虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by XOooZzz at 2012-05-30 10:22:22
用乙醇洗时刚开始有沉淀，后来没有了？？干燥后的DNA应该像一小块保鲜膜一样贴在离心管底部。溶解后的DNA溶液明显比水粘稠。

异戊醇沉淀后，干燥时间久一点，沉淀就会溶解掉。乙醇干燥也一样。。。请问正常吗？
另外，我看很多贴子，我也想了很久，我想有可能是我配的饱和苯酚的问题。我今天又重新配了，但是无论怎么样，我好像都调不到8.0。。。而且tris加多了，水相竟没有了。。。ph计测，好像到了8.5.。。不知道有没有问题。。。
今晚我又重新提了，明天测结果。。
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5楼2012-05-30 22:14:51
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Janual

银虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by 早冰124 at 2012-05-30 11:05:05
我们提质粒都是用试剂盒的，一般要获取大量的质粒会增大裂解液buffer p1的用量，裂解时间也稍稍长些，3-4min, 后面的中和反应液也相对加大，即buffer p1 到buffer p3都相应的加大量，当然这前提是你菌体要养的足够多 ...

嗯嗯，实在不行，就只能买试剂盒了。。。
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6楼2012-05-30 22:15:50
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jqq1985

银虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by Janual at 2012-05-30 22:14:51
异戊醇沉淀后，干燥时间久一点，沉淀就会溶解掉。乙醇干燥也一样。。。请问正常吗？
另外，我看很多贴子，我也想了很久，我想有可能是我配的饱和苯酚的问题。我今天又重新配了，但是无论怎么样，我好像都调不到8. ...

提质粒怎么会用到Tris饱和酚呢》？那个似乎是提基因组DNA时候才用的吧？提质粒是P1，P2和P3。
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7楼2012-05-30 22:29:02
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XOooZzz

银虫 (小有名气)
你想要获得“大量”是指多大的量？ug？mg？g？
异丙醇沉淀后，倒掉上清即可，无需干燥。直接加预先配好的70%乙醇到离心管中，用枪打几下吹散沉淀，摇晃几下就可以离心。离心后能看到明显的沉淀，再倒掉上清干燥，用水溶解。
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8楼2012-05-30 22:32:14
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Janual

银虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by XOooZzz at 2012-05-30 22:32:14
你想要获得“大量”是指多大的量？ug？mg？g？
异丙醇沉淀后，倒掉上清即可，无需干燥。直接加预先配好的70%乙醇到离心管中，用枪打几下吹散沉淀，摇晃几下就可以离心。离心后能看到明显的沉淀，再倒掉上清干燥，用 ...

我总共要好几mg
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9楼2012-05-30 23:57:33
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XOooZzz

银虫 (小有名气)
★ ★ ★
西瓜: 金币+3, 鼓励多多交流 2012-05-31 09:41:42
引用回帖:
9楼: Originally posted by Janual at 2012-05-30 23:57:33
我总共要好几mg...

那么你是用哪种方法提的呢？我只知道质粒小提的加溶液1、2、3的方法。不过估计原理都差不多。其实，我有点看不太明白你的实验步骤...你用异丙醇沉淀后先干燥再用乙醇洗涤？用乙醇洗涤时方法不对的话是会溶解DNA的，这样的话，在最后一步离心基本上就没有沉淀了，但这时可以适当加些盐，使DNA再次沉淀就可以了。
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10楼2012-05-31 01:04:41
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