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Janual

银虫 (小有名气)

[求助] 想获得较大量的pBR322,却怎么也提不出来,各位大侠帮帮忙……

我把质粒转入大肠杆菌,然后摇床扩增,按照分子生物学克隆指南的中提步骤做,加入异丙醇后,离心,有沉淀,而且不少,乙醇洗,开始还有沉淀,但是等它挥发干的时候,沉淀好像不见了。就算沉淀还在,电泳后,也没有条带。很悲剧啊,重复了两次了。这是为什么呢?平板含有氨苄,试管扩增时也有氨苄,三角瓶扩增时也加了氨苄,菌液浓度比较好。跟我之前用小提试剂盒提时养的菌是一样的
为什么提不出来?
各位大侠,我要怎么样才能获得较大量的质粒呢?万分感激!!!
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早冰124

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-05-30 13:43:12
我们提质粒都是用试剂盒的,一般要获取大量的质粒会增大裂解液buffer p1的用量,裂解时间也稍稍长些,3-4min, 后面的中和反应液也相对加大,即buffer p1 到buffer p3都相应的加大量,当然这前提是你菌体要养的足够多。现在也有质粒小题中量提取试剂盒,可以试试

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4楼2012-05-30 11:05:05
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XOooZzz

银虫 (小有名气)

用乙醇洗时刚开始有沉淀,后来没有了??干燥后的DNA应该像一小块保鲜膜一样贴在离心管底部。溶解后的DNA溶液明显比水粘稠。

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3楼2012-05-30 10:22:22
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Janual

银虫 (小有名气)

送鲜花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by XOooZzz at 2012-05-30 10:22:22
用乙醇洗时刚开始有沉淀,后来没有了??干燥后的DNA应该像一小块保鲜膜一样贴在离心管底部。溶解后的DNA溶液明显比水粘稠。

异戊醇沉淀后,干燥时间久一点,沉淀就会溶解掉。乙醇干燥也一样。。。请问正常吗?
另外,我看很多贴子,我也想了很久,我想有可能是我配的饱和苯酚的问题。我今天又重新配了,但是无论怎么样,我好像都调不到8.0。。。而且tris加多了,水相竟没有了。。。ph计测,好像到了8.5.。。不知道有没有问题。。。
今晚我又重新提了,明天测结果。。
5楼2012-05-30 22:14:51
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Janual

银虫 (小有名气)

送鲜花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by 早冰124 at 2012-05-30 11:05:05
我们提质粒都是用试剂盒的,一般要获取大量的质粒会增大裂解液buffer p1的用量,裂解时间也稍稍长些,3-4min, 后面的中和反应液也相对加大,即buffer p1 到buffer p3都相应的加大量,当然这前提是你菌体要养的足够多 ...

嗯嗯,实在不行,就只能买试剂盒了。。。
6楼2012-05-30 22:15:50
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