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[交流]
电泳图谱咋这个样子，求助啊！
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发觉自己的DNA电泳谱图老是很分得不好，有时候有很严重的拖尾现象。上次看到楼上实验室的师姐做得就非常清晰，每个band都分得很开，而且没有拖尾。我一般做电泳的条件是： 1.电压为80mV， 2.电泳时间一般为25－30min 3.一般吸取5ul待测DNA悬液，加到1ul loading buffer上混匀，然后加入well. 感觉条带总是不好，用的是Bio-rad的凝胶成像仪。 我最近做的一张图谱再附件里。 想请问各位前辈： 1.电泳电压对band的清晰度和分辨率影响有多大？ 2.loading buffer的加量要遵守什么哪些条件，是不是有比例的？ 3.怎么才能让电泳图看上去好些呢？ |
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2楼2007-04-21 11:12:49
3楼2007-04-21 11:15:28
lys6827
木虫 (著名写手)
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4楼2007-04-21 11:55:08
★ ★
dfggc(金币+2):多谢交流
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1 由于DNA分子量很大，一般建议用0.5-0.8%胶来电泳。PCR产物基本上可以根据分子量来决定胶浓度，一般用1-1.5%的胶浓度。所以建议，你用两块胶分别来跑DNA和PCR产物。 2 电泳电压对band的清晰度和分辨率是由影响的，电压的大小取决于你用的电泳槽正负极间的距离，一般是3-5V/cm。电压过高或过低，对band的清晰度和分辨率都是有影响的。 3 loading buffer的加量，要取决于你用的是几乘的loading buffer，如果是6Xloading buffer，loading buffer的量为你点样量的1/6，那么如果你点样5-6ul，加1ul loading buffer是可以的。如果用的是10Xloading buffer，loading buffer的量为你点样量的1/10，即如果你点样5ul，加0.5ul loading buffer就可以了。但是一般情况下，loading buffer量的多少对于条带的清晰与美观并无太大关系。 4 我们lab用的也是BIO-RAD的凝胶成像系统，说实话，你的条带是不太清晰。 建议A你用制胶的梳子时选择梳子空扁长的，那么条带会好看些。胶浓度也要相应调整。 B因为你的MARKER也不大漂亮，建议电压要优化些，电泳时间要视溴酚兰位于凝胶2/3位置时，可以停止电压。 C 还有你的电泳缓冲液，无论是TBE或是TAE，建议你换新的来电泳。一步步排除问题。 最后，祝你好运！呵呵 |
5楼2007-04-21 12:39:07
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1 由于DNA分子量很大，一般建议用0.5-0.8%胶来电泳。PCR产物基本上可以根据分子量来决定胶浓度，一般用1-1.5%的胶浓度。所以建议，你用两块胶分别来跑DNA和PCR产物。 2 电泳电压对band的清晰度和分辨率是由影响的，电压的大小取决于你用的电泳槽正负极间的距离，一般是3-5V/cm。电压过高或过低，对band的清晰度和分辨率都是有影响的。 3 loading buffer的加量，要取决于你用的是几乘的loading buffer，如果是6Xloading buffer，loading buffer的量为你点样量的1/6，那么如果你点样5-6ul，加1ul loading buffer是可以的。如果用的是10Xloading buffer，loading buffer的量为你点样量的1/10，即如果你点样5ul，加0.5ul loading buffer就可以了。但是一般情况下，loading buffer量的多少对于条带的清晰与美观并无太大关系。 4 我们lab用的也是BIO-RAD的凝胶成像系统，说实话，你的条带是不太清晰。 建议A你用制胶的梳子时选择梳子空扁长的，那么条带会好看些。胶浓度也要相应调整。 B因为你的MARKER也不大漂亮，建议电压要优化些，电泳时间要视溴酚兰位于凝胶2/3位置时，可以停止电压。 C 还有你的电泳缓冲液，无论是TBE或是TAE，建议你换新的来电泳。一步步排除问题。 最后，祝你好运！呵呵 |
6楼2007-04-21 12:41:39
7楼2007-04-21 18:49:17
8楼2007-04-21 20:29:09
randomqd
木虫 (小有名气)
樱花骑士
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9楼2007-04-22 00:52:41
10楼2007-04-22 17:22:58
