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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 存档旧帖 » DNA 3' 5'问题
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暂定

金虫 (初入文坛)

[求助] DNA 3' 5'问题

小白求问各位大神：
1. DNA的5'端磷酸末端和3'羟基末端是正常情况下的吧？那何时会出现3'磷酸末端还有5'羟基末端？是用酶作用的么？哪些酶搞的？
2. lambda 外切酶切的是双链DNA的5' 磷酸化链，这个磷酸化是不是不同于DNA5'端本身有的磷酸末端？那它具体是什么意思呢？
3. 用酶切反应的时候，有一个酶的反应缓冲液，请问，稀释这个缓冲液是用什么呢？纯水？还是其它缓冲液？比如用于单链杂交成双链的PBS加镁缓冲液可以么？
4. 缓冲液怎么用呢，比如说我拿的是10倍的缓冲液，是不是我的DNA溶液有180微升时，就加20微升缓冲液，这样正好是1倍的缓冲液呢？


求问各位大神，助我解惑啊，多谢多谢
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1楼 2012-05-23 11:31:47
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暂定

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-05-23 12:48:48:
嗯...................
       1. 是有酶作用的 比方说做RACE中就有用到碱性磷酸酶 可以作用脱掉5‘的磷酸基团
       2. 这个外切酶应该识别的是5’的磷酸化基团 （没有做过 个人理解）
       3. 你指的稀释是

我还想追问一下，嘿嘿，您告诉我说稀释不用缓冲液，但是例如第4个问题，我的DNA溶液是用PBS缓冲液配制的，那再往里加酶时，要怎么办呢？
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3楼2012-05-23 14:19:32
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+5, 鼓励应助 2012-05-23 14:07:46
暂定: 金币+5, ★★★很有帮助, 多谢您回答啦 2012-05-23 14:17:50
西瓜: MolEPI+1, 补上EPI。辛苦哈 2012-05-27 12:52:21
嗯...................
       1. 是有酶作用的 比方说做RACE中就有用到碱性磷酸酶 可以作用脱掉5‘的磷酸基团
       2. 这个外切酶应该识别的是5’的磷酸化基团 （没有做过 个人理解）
       3. 你指的稀释是用ddH2O来补足体系吧 这样的话一般灭菌蒸馏水或millipore级纯水就可以了 不用缓冲液的 用了缓冲液可能带来额外的离子和影响离子强度从而对酶切产生作用
       4. 正如你所说10X换算成1X就拿你的溶液/9的体积来添加缓冲液就可以了
       个人看法 若有说错请高手指点
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Let God do with it as He wills
2楼2012-05-23 12:48:48
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气
引用回帖:
3楼: Originally posted by 暂定 at 2012-05-23 14:19:32:
我还想追问一下，嘿嘿，您告诉我说稀释不用缓冲液，但是例如第4个问题，我的DNA溶液是用PBS缓冲液配制的，那再往里加酶时，要怎么办呢？

做酶有关的实验时 如果补足体系 均是使用ddH2O 不会用其他缓冲液的
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暂定
Let God do with it as He wills
4楼2012-05-23 14:31:42
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暂定

金虫 (初入文坛)
送鲜花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-05-23 14:31:42:
做酶有关的实验时 如果补足体系 均是使用ddH2O 不会用其他缓冲液的

噢 那DNA也是用纯水溶的么？或者DNA是用酶的反应缓冲液溶的？
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5楼2012-05-23 15:38:45
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