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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 酶活测定
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thestormcong

银虫 (小有名气)

[求助] 酶活测定

大家好！小弟现在想测我自己从胞内裂解出来的粗酶液的酶活。可是不知道如何确定底物和酶的量，是不是底物要过量？我是用分光光度计测定产物生成量来计算酶活的。怎么样摸索这个量呢？还有消光系数跟OD值和酶有什么关系呢？
    小弟接触酶学不久，还有很多不清楚的地方，希望得到有经验的虫友的帮助，非常感谢！
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1楼 2012-05-13 22:40:07
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

凌波丽

专家顾问 (知名作家)
★
西瓜: 金币+1, 鼓励交流~欢迎凌波同学归来 2012-05-18 14:33:35
Enzyme Assays----A Practical Approach(2002).
http://ishare.iask.sina.com.cn/f/24494635.html
参考一下吧。
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thestormcong
10楼2012-05-18 13:11:37
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普通回帖

yahubibi
2楼2012-05-13 23:45:56
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crazymouse66

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-05-14 13:44:35
thestormcong: 金币+3, ★有帮助 2012-05-14 18:38:55
这个底物和酶的量是要不断摸索的。在你把反应体系加进去后测相应吸光值的变化，那时你要看你吸光值的变化，若反应过快，你则要调整酶和底物的量，此时你找到一个适合的量。测吸光值的变化时的时间间隔也是要自己摸索的，比如十秒测一个值，测十个值。然后你用时间间隔和相应的OD值做一条直线，此时的斜率就是你要的值。因为规定的是OD值每变化0.01为一个酶活单位,所以你此时的斜率还要乘以100，再除以你测的可溶性蛋白的量，就是你要的酶活了。单位是U/mg protein
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thestormcong
3楼2012-05-13 23:52:08
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sosako

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-05-14 13:44:44
thestormcong: 金币+2, ★有帮助 2012-05-14 18:38:22
酶活力-速率法测定酶促反应中底物或产物随时间的变化量。该方法每隔一定时间(10～60s)测定底物或产物的变化量，在线性期内确定每分钟平均吸光度值(△A／min)，并计算出酶活力单位。该方法要求分析仪器具有恒温装置和自动监测功能。半自动生化分析仪和微量流动比色计均能满足这些要求。
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4楼2012-05-13 23:53:05
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starseacow

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
酶量一开始做楼主可以以样品中总蛋白量代替
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植物生理群69993869，为避免广告，申请加入请提供木虫昵称，院校及专业信息
5楼2012-05-14 03:11:12
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shenlin0514

木虫 (正式写手)

无名小虫

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-05-14 13:44:57
thestormcong: 金币+7, ★★★★★最佳答案, 谢谢师兄的意见。可我没有你说的那个说明书。师兄能否共享下啊？ 2012-05-14 18:35:06
楼主可以多参考toyobo或者kikkoman的酶说明书，上面有很规范的测活方案，你可以参考一下，然后设计自己的方案，最主要的一点就是底物过量，然后使酶量能够控制在一个范围，即范围内酶量与反应速率呈线性，一般都在0.05-1U/ml
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Never say never
6楼2012-05-14 10:28:15
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zcy1214

木虫 (著名写手)

普通青年
咱也刚开始学，等我思路准备好了，再好好的交流哈
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达则兼济天下，穷则独善其身
7楼2012-05-15 21:49:08
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thestormcong

银虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by crazymouse66 at 2012-05-13 23:52:08:
这个底物和酶的量是要不断摸索的。在你把反应体系加进去后测相应吸光值的变化，那时你要看你吸光值的变化，若反应过快，你则要调整酶和底物的量，此时你找到一个适合的量。测吸光值的变化时的时间间隔也是要自己摸 ...

师兄好，为什么说一个酶活单位规定为OD值变化0.01，这里不是很明白，请指教！
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8楼2012-05-17 23:33:59
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crazymouse66

金虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by thestormcong at 2012-05-17 23:33:59:
师兄好，为什么说一个酶活单位规定为OD值变化0.01，这里不是很明白，请指教！

可别喊我师兄啊，我也是研一的，大家都是一样的，哈哈。那个我也是从别的论文里看来的，我们实验室测过SOD，APX等用的就是方法，我自己后来测的与光合作用有关的酶的活性，看了很多文献也都是这样定义的。建议你也可以看一下你要测的酶的相关论文，一般都会有方法的。
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9楼2012-05-18 08:47:36
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