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thestormcong

银虫 (小有名气)

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[求助] 酶活测定

大家好！小弟现在想测我自己从胞内裂解出来的粗酶液的酶活。可是不知道如何确定底物和酶的量，是不是底物要过量？我是用分光光度计测定产物生成量来计算酶活的。怎么样摸索这个量呢？还有消光系数跟OD值和酶有什么关系呢？
小弟接触酶学不久，还有很多不清楚的地方，希望得到有经验的虫友的帮助，非常感谢！

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1楼2012-05-13 22:40:07

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shenlin0514

木虫 (正式写手)

无名小虫

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-05-14 13:44:57
thestormcong: 金币+7, ★★★★★最佳答案, 谢谢师兄的意见。可我没有你说的那个说明书。师兄能否共享下啊？ 2012-05-14 18:35:06

楼主可以多参考toyobo或者kikkoman的酶说明书，上面有很规范的测活方案，你可以参考一下，然后设计自己的方案，最主要的一点就是底物过量，然后使酶量能够控制在一个范围，即范围内酶量与反应速率呈线性，一般都在0.05-1U/ml

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Never say never

6楼2012-05-14 10:28:15

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crazymouse66

金虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-05-14 13:44:35
thestormcong: 金币+3, ★有帮助 2012-05-14 18:38:55

这个底物和酶的量是要不断摸索的。在你把反应体系加进去后测相应吸光值的变化，那时你要看你吸光值的变化，若反应过快，你则要调整酶和底物的量，此时你找到一个适合的量。测吸光值的变化时的时间间隔也是要自己摸索的，比如十秒测一个值，测十个值。然后你用时间间隔和相应的OD值做一条直线，此时的斜率就是你要的值。因为规定的是OD值每变化0.01为一个酶活单位,所以你此时的斜率还要乘以100，再除以你测的可溶性蛋白的量，就是你要的酶活了。单位是U/mg protein

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