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有关PCR引物的问题
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大家好，在此请教各位几个问题 1.做PCR的引物是一般自己设计还是参考文献，如果自己设计引物一般扩增多少个碱基比较好？ 2.测人体血细胞和A549细胞中的RANTES变化可以用相同的RANTES和内参基因β-actin 引物吗？ 3.选择好了目的基因和内参基因，一定要做标准曲线确定它们扩增效率相同才可以采用-ΔΔCt法定量吗，做标准曲线时，一般是采用自己提取反转录的cDNA还是买标准品？ 4.如果是想找生工或者华大设计RANTES的引物需要提供RANTES所有的序列吗，价格一般是多少？ 谢谢大家！ |
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 【分子生物】EPI帖 |
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孙启亮
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+3, MolEPI+1, 鼓励发帖帮助解答问题。 2012-05-05 20:18:23
821078607: 金币+10, 谢谢你哈 2012-05-06 12:32:51
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1 首先建议自己设计引物，文献上发表的引物并非绝对可信啊，尤其是EF低的文献。荧光定量的产物长度一般为100-200bp 2 没细查你的细胞是啥细胞，只要细胞系来自同一物种，理论上引物通用。只是扩增效率和反应条件有微小的不一样。 3 定量的前提是你的目的基因能用于定量，-ΔΔCt法应用的前提是目的基因和内参基因的扩增效率一样，所以为了验证你的公式是否适用于你的计算，肯定要做引物的扩增效率。做扩增效率当然要做标曲，因为你的实验应该是相对定量，所以不需要 标准品。 4我曾经打电话给生工，把他们骂了一顿，原因就是我询问他们是否可以提供引物设计服务但是他们没回复邮件。在我骂完他们之后，他们回复了邮件提供了他们帮我设计的引物，虽然是免费的，设计的质量水平一般，但是不能用，我那基因确实很难扩。在我印象里他们是不提供设计引物服务的。 |
2楼2012-05-05 18:42:54
3楼2012-05-06 12:38:57