| 查看: 4586 | 回复: 26 | ||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||
johnny4890新虫 (小有名气)
|
[求助]
提取RNA与做RT-PCR的问题
|
|
最近从霉菌中提取总rna，质量不好，反转录老是做不出来，而且pcr的时候经常把水那组p出条带来==。请大家给我点意见。先看看我的总rna电泳图。 （第一次） （第二次）所用的protocol是网上下载的山寨版本。如下： RNA的提取 准备试剂：氯仿，异丙醇，75℅乙醇，无RNase的水或0.5℅SDS(溶液均需用DEPC处理过的水配制) 操作步骤: 1. 匀浆处理:a.组织 将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。 b.单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml，用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。 c．细胞悬液 离心收集细胞，每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol，反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。 2．将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。 5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。 6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。 7. 把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。 8. 2-8℃10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。 9. 用75℅乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75℅乙醇。2-8℃不超过7500×g离心5分钟，弃上清。 10.室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾5-10分钟即可.。加入25-200μl无RNase的水或0.5℅SDS,用枪头吸打几次,55-60℃放置10分钟使RNA溶解.如RNA用于酶切反应,勿使用SDS溶液。RNA也可用100℅的去离子甲酰胺溶解，-70℃保存。 |
回复此楼» 猜你喜欢
Wnt-C59：PORCN靶向化学探针，Wnt信号通路阻断机制与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有215人回复
-
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析
已经有0人回复
-
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析
已经有0人回复
-
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点
已经有0人回复
-
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复
-
氢氧化钾活化操作
已经有18人回复
-
散金
已经有68人回复
-
生物质超级电容器
已经有0人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
johnny4890
新虫 (小有名气)
- 应助: 2 (幼儿园)
- 金币: 160.9
- 散金: 254
- 红花: 1
- 帖子: 260
- 在线: 106.8小时
- 虫号: 1453168
- 注册: 2011-10-20
- 专业: 微生物生理与生物化学
11楼2012-05-02 13:51:18
atlanticwi
金虫 (正式写手)
琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气
- MolEPI: 25
- 应助: 138 (高中生)
- 金币: 141.2
- 散金: 350
- 红花: 13
- 帖子: 536
- 在线: 313.2小时
- 虫号: 1099992
- 注册: 2010-09-15
- 专业: 植物生理与生化
【答案】应助回帖
★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 呵呵，欢迎交流 2012-05-02 13:38:59
johnny4890: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-05-02 21:38:16
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 呵呵，欢迎交流 2012-05-02 13:38:59
johnny4890: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-05-02 21:38:16
|
嗯................ 我觉得，这样的RNA肯定是不能用的，电泳结果显示出你的RNA降解的比较严重，同样有Smear的话，基因组DNA还是有污染的，网上的这个Protocol我看基本的操作没有问题，主要是TRIzol试剂你是怎么配的呢，还是买的商业化TRIzol？同样具体应用到你菌的RNA提取上，不知道这个Protocol是否适用............. 个人看法 若有说错请高手指点  |
2楼2012-04-30 20:38:11
johnny4890
新虫 (小有名气)
- 应助: 2 (幼儿园)
- 金币: 160.9
- 散金: 254
- 红花: 1
- 帖子: 260
- 在线: 106.8小时
- 虫号: 1453168
- 注册: 2011-10-20
- 专业: 微生物生理与生物化学
3楼2012-04-30 20:47:45
atlanticwi
金虫 (正式写手)
琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气
- MolEPI: 25
- 应助: 138 (高中生)
- 金币: 141.2
- 散金: 350
- 红花: 13
- 帖子: 536
- 在线: 313.2小时
- 虫号: 1099992
- 注册: 2010-09-15
- 专业: 植物生理与生化
4楼2012-04-30 20:49:31
28