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wushuwei1104

银虫 (小有名气)

[求助] 筛选重组子

最近要做原核表达,用BL21(DE3)菌株,这个菌株是没有任何外源载体和抗性的,我要转化的载体和重组载体都只有一个抗性基因,也就是说重组子和自连的表达载体具有相同的抗性且只有一个抗性,像这样的话应该怎样筛选重组子,有没有办法?  谢谢各位大侠了!!!


说明:在抗性培养基中长出的菌落有可能含有重组子,也有可能含有自连的表达载体。应该怎样筛选?  难道真要一个一个的挑取单菌落,在摇菌培养,提取质粒电泳检测吗?   麻烦呀!!!
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勤能补拙
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张宏宇123

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
西瓜: 金币+1, 鼓励交流 2012-04-29 16:44:57
一般都是在别的菌里把质粒构建好,然后再转到BL21(DE3)里,转进去提质粒验证大小对了就可以了。
未来不是梦
2楼2012-04-28 11:32:50
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zhsDONG

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
西瓜: 金币+1, 鼓励交流 2012-04-29 16:45:04
可以跑质粒快检呀!初步鉴定是不是重组质粒呀!在做下一步判断啊。
3楼2012-04-28 13:45:53
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
西瓜: 金币+1, 专家考核, 鼓励 2012-04-29 16:45:14
提质粒电泳太麻烦了,做菌落PCR快速。
4楼2012-04-28 16:04:54
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chaovt714

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
西瓜: 金币+1, 鼓励 2012-04-29 16:45:27
这种情况有点像构建广库,像这样的话一般将载体酶切后连接之前进行去磷酸化处理,这个可以降低自连出现的机率,重组子转化后划线扩增培养,再进行快速裂解与原质粒对照大小初步检测。。。
5楼2012-04-28 19:50:41
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shicaozhu

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
wushuwei1104: 金币+1, ★★★★★最佳答案 2012-05-01 21:49:39
现在JM109里面构建重组质粒,等转化子长出来之后,蘸取转化子做一次菌落PCR,同时将转化子点种在另一块平板上做个保种,然后将PCR反应阳性的转化子接几个到摇瓶里,提质粒,然后双酶切验证,将酶切反应正确的质粒先测个序,然后再转BL21,这样的话成功率比较高,顺利的话一周半就出结果了。
6楼2012-04-30 10:53:28
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wushuwei1104

银虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 张宏宇123 at 2012-04-28 11:32:50:
一般都是在别的菌里把质粒构建好,然后再转到BL21(DE3)里,转进去提质粒验证大小对了就可以了。

谢谢仁兄!
勤能补拙
7楼2012-05-01 21:50:21
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wushuwei1104

银虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by zhsDONG at 2012-04-28 13:45:53:
可以跑质粒快检呀!初步鉴定是不是重组质粒呀!在做下一步判断啊。

谢谢仁兄的帮助!
勤能补拙
8楼2012-05-01 21:50:36
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wushuwei1104

银虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by lxj341401 at 2012-04-28 16:04:54:
提质粒电泳太麻烦了,做菌落PCR快速。

谢谢仁兄的帮助!!
勤能补拙
9楼2012-05-01 21:50:59
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wushuwei1104

银虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by shicaozhu at 2012-04-30 10:53:28:
现在JM109里面构建重组质粒,等转化子长出来之后,蘸取转化子做一次菌落PCR,同时将转化子点种在另一块平板上做个保种,然后将PCR反应阳性的转化子接几个到摇瓶里,提质粒,然后双酶切验证,将酶切反应正确的质粒 ...

谢谢仁兄帮助!!
勤能补拙
10楼2012-05-01 21:51:24
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