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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 筛选重组子
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wushuwei1104

银虫 (小有名气)

[求助] 筛选重组子

最近要做原核表达，用BL21(DE3)菌株，这个菌株是没有任何外源载体和抗性的，我要转化的载体和重组载体都只有一个抗性基因，也就是说重组子和自连的表达载体具有相同的抗性且只有一个抗性，像这样的话应该怎样筛选重组子，有没有办法？  谢谢各位大侠了！！！


说明：在抗性培养基中长出的菌落有可能含有重组子，也有可能含有自连的表达载体。应该怎样筛选？  难道真要一个一个的挑取单菌落，在摇菌培养，提取质粒电泳检测吗？   麻烦呀！！！
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勤能补拙
1楼 2012-04-28 11:29:09
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张宏宇123

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+1, 鼓励交流 2012-04-29 16:44:57
一般都是在别的菌里把质粒构建好，然后再转到BL21（DE3)里，转进去提质粒验证大小对了就可以了。
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未来不是梦
2楼2012-04-28 11:32:50
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zhsDONG

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+1, 鼓励交流 2012-04-29 16:45:04
可以跑质粒快检呀！初步鉴定是不是重组质粒呀！在做下一步判断啊。
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3楼2012-04-28 13:45:53
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+1, 专家考核, 鼓励 2012-04-29 16:45:14
提质粒电泳太麻烦了，做菌落PCR快速。
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4楼2012-04-28 16:04:54
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chaovt714

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+1, 鼓励 2012-04-29 16:45:27
这种情况有点像构建广库，像这样的话一般将载体酶切后连接之前进行去磷酸化处理，这个可以降低自连出现的机率，重组子转化后划线扩增培养，再进行快速裂解与原质粒对照大小初步检测。。。
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5楼2012-04-28 19:50:41
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shicaozhu

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
wushuwei1104: 金币+1, ★★★★★最佳答案 2012-05-01 21:49:39
现在JM109里面构建重组质粒，等转化子长出来之后，蘸取转化子做一次菌落PCR，同时将转化子点种在另一块平板上做个保种，然后将PCR反应阳性的转化子接几个到摇瓶里，提质粒，然后双酶切验证，将酶切反应正确的质粒先测个序，然后再转BL21，这样的话成功率比较高，顺利的话一周半就出结果了。
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6楼2012-04-30 10:53:28
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wushuwei1104

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 张宏宇123 at 2012-04-28 11:32:50:
一般都是在别的菌里把质粒构建好，然后再转到BL21（DE3)里，转进去提质粒验证大小对了就可以了。

谢谢仁兄！
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勤能补拙
7楼2012-05-01 21:50:21
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wushuwei1104

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by zhsDONG at 2012-04-28 13:45:53:
可以跑质粒快检呀！初步鉴定是不是重组质粒呀！在做下一步判断啊。

谢谢仁兄的帮助！
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勤能补拙
8楼2012-05-01 21:50:36
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wushuwei1104

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by lxj341401 at 2012-04-28 16:04:54:
提质粒电泳太麻烦了，做菌落PCR快速。

谢谢仁兄的帮助！！
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勤能补拙
9楼2012-05-01 21:50:59
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wushuwei1104

银虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by shicaozhu at 2012-04-30 10:53:28:
现在JM109里面构建重组质粒，等转化子长出来之后，蘸取转化子做一次菌落PCR，同时将转化子点种在另一块平板上做个保种，然后将PCR反应阳性的转化子接几个到摇瓶里，提质粒，然后双酶切验证，将酶切反应正确的质粒 ...

谢谢仁兄帮助！！
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勤能补拙
10楼2012-05-01 21:51:24
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