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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » OVER-LAP PCR第二轮扩增不出来条带
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rainbow8

新虫 (小有名气)

[求助] OVER-LAP PCR第二轮扩增不出来条带 已有1人参与

构建质粒，用overlapPCR，一个小片段（1k）,线性质粒（6k）单独P的时候都P出来了 小片段37ng/ul，大片段5ng/ul，两个片段overlap的时候却p不出来了 我用100ul的体系，引物两个各家4ul，模板等摩尔加的，没有条带。。。请求各位高手帮忙解决。
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学海无涯，回头是岸
1楼 2012-04-13 19:15:11
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rainbow8

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by xinshen0915 at 2012-04-13 20:01:53:
1、换个小点的体系，用20ul的体系试一下；
2、可以考虑把两个片段回收之后再做模板，我以前做overlapping也遇到过这种情况，将片段回收之后做模板就扩出来了；
3、确保两条引物的退火温度相差不大于5度，可以考 ...

我的退火温度都是55℃
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学海无涯，回头是岸
4楼2012-04-14 21:30:25
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xinshen0915

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-05-28 16:02:06
1、换个小点的体系，用20ul的体系试一下；
2、可以考虑把两个片段回收之后再做模板，我以前做overlapping也遇到过这种情况，将片段回收之后做模板就扩出来了；
3、确保两条引物的退火温度相差不大于5度，可以考虑梯度扩增。
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Go home or stand up！It's your fucking choice.Do you still remember the reason why you are here?
2楼2012-04-13 20:01:53
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rainbow8

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by xinshen0915 at 2012-04-13 20:01:53:
1、换个小点的体系，用20ul的体系试一下；
2、可以考虑把两个片段回收之后再做模板，我以前做overlapping也遇到过这种情况，将片段回收之后做模板就扩出来了；
3、确保两条引物的退火温度相差不大于5度，可以考 ...

什么是梯度扩增？
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学海无涯，回头是岸
3楼2012-04-14 21:28:18
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ccharlien

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

一楼，楼主都分别说出两个片段的浓度了，当然是回收过了的呀。我觉得你的大片段是??是浓度有点太低了，纯度太低。最好用它当模?????扩一次，最好两个片段的浓度相当。
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5楼2012-05-28 14:36:57
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