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happywyh

铁虫 (小有名气)

[求助] PCR

PCR产物跑电泳，没有目的条带，有类似是引物二聚体的条带，什么原因造成的？？
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1楼 2012-04-10 21:43:49
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孙启亮

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
很有可能是引物没设计好，建议重新设计引物，然后摸索条件
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2楼2012-04-10 22:11:10
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imyting

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 太正确了，PCR不成功的因素是多方面的 2012-04-11 08:26:11
可能的原因太多了
1：引物量过多，退火温度较低，造成引物形成二聚体不能与模板结合；
2：退火温度太高，引物不能与模板集合；
3：PCR仪插孔老化，建议换些插孔试试；
4：Taq酶失活、体系不好、模板不对等等；
5：然后就是引物不好
    如果确定这些都不是原因，可再次重复……
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悠哉游哉做实验，成兮败兮我随便
3楼2012-04-11 00:02:36
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wtyyyyy1988

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 跑内参是很有必要的，鼓励应助，常来哦 2012-04-11 08:27:13
第一，你是否确定你的cDNA没有问题，可以跑个内参看看 ；第二，如果模板没问题，你的目的条带含量是否很低？引物特异性是否很好？

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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我就是我
4楼2012-04-11 00:11:32
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happywyh

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by imyting at 2012-04-11 00:02:36:
可能的原因太多了
1：引物量过多，退火温度较低，造成引物形成二聚体不能与模板结合；
2：退火温度太高，引物不能与模板集合；
3：PCR仪插孔老化，建议换些插孔试试；
4：Taq酶失活、体系不好、模板不对等等； ...

之前有一次用菌落PCR，疑似有目的条带和二聚体形成，之后再做就没有目的带
其他条件是不变的
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5楼2012-04-11 10:39:34
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imyting

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

可以把退火温度提高一下看看，或者做个梯度吧……
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悠哉游哉做实验，成兮败兮我随便
6楼2012-04-11 12:33:54
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
2个办法，
1， 根绝三楼的建议，控制一个量变，其他不变，找出原因。
2， 从头到尾重新做，所有PCR用到的TAQ, BUFFER, 模板，引物等一律全换新的
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7楼2012-04-11 12:34:57
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
原因无比之多。。。
引物
退火温度
延伸时间
酶
等等。。。。
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
8楼2012-04-11 19:10:08
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cheng_xiao

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
楼上说了很多，最重要的就是引物，如果你确定你的引物没什么大问题的话，很有可能就是基因本身表达的问题，因为你说你菌落PCR看到结果了，这个结果是以基因组为模版得到的，所以你可以通过一些方法来提高你基因的表达量，而后你再试一下，好运啊、、、
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我努力我奋斗我成功
9楼2012-04-11 20:39:01
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风逝zhilv

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
正如楼上各位所说，原因很多，不要盲目重复试验，好好回顾比较一下，找找两次实验的差异，细到每个步骤，尤其是引物的稀释！祝好运！
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为梦想而努力，不做生活的奴隶！
10楼2012-04-12 00:30:08
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