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laverne

铜虫 (小有名气)

[交流] 蛋白突变后不表达了 已有4人参与

大家好，我现在实验遇到个现象，苦恼ing，烦请大家给予指点
定点突变蛋白之后，在bl21中不表达了，尝试各种优化，没有效果，有人能解释这是什么原因吗？
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为了更好的生活……
1楼 2012-04-10 16:32:58
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laverne

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 凌波丽 at 2012-04-20 17:13:50:
一般来讲，先确定新的启动子存在且有效，其次确定起始转录位点存在且有效，然后有软件模拟一下mRNA突变后是否构成了二级结构，是否有移码突变，是否构成了稀有密码子，是否提前中断翻译，再有考虑突变产物蛋白质是 ...

谢谢您的意见！
首先，蛋白突变只发生在c端（原始的蛋白表达量还可以），不涉及启动子以及转录起始位点的变化。
其次，测序结果认真查看了没有发生移码，也没有终止密码子提前形成。
另外，想要跟您请教的是：
我用软件模拟了mRNA突变后的二级结构，看上去是发生了挺大的改变。但是我不知道这个模拟结果该如何分析？您是否可以给些意见？
从自由能来看，原始的是－229kkal/mol, 突变后是－200kkal/mol
ps:由于目标蛋白带有his标签，纯化后完全木有东西，所以没法考虑聚合体形成的问题。
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为了更好的生活……
5楼2012-04-23 18:48:37
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dreamofyou

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
这个很正常吧，有的本来表达很好，突变了一个氨基酸表达差很多。
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3楼2012-04-20 16:38:53
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西瓜: 金币+5, MolEPI+1, 应助指数+1, 果然专业！ 2012-04-23 18:50:33
一般来讲，先确定新的启动子存在且有效，其次确定起始转录位点存在且有效，然后有软件模拟一下mRNA突变后是否构成了二级结构，是否有移码突变，是否构成了稀有密码子，是否提前中断翻译，再有考虑突变产物蛋白质是否构成新的酶切位点和是否在三维结构上发生了折叠异常（引入突变位点也是研究蛋白质折叠的一种常规实验技术）。

还要考虑突变产物蛋白质是不是参与形成了原来没有的超分子结构（聚合体）或者影响了原有的四级结构的形成。
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4楼2012-04-20 17:13:50
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
5楼: Originally posted by laverne at 2012-04-23 18:48:37:
谢谢您的意见！
首先，蛋白突变只发生在c端（原始的蛋白表达量还可以），不涉及启动子以及转录起始位点的变化。
其次，测序结果认真查看了没有发生移码，也没有终止密码子提前形成。
另外，想要跟您请教的是： ...

一般来说，由于真核生物细胞中的由于存在翻译起始因子eIF4A,eIF4B在核糖体翻译时去除mRNA的二级结构，所以只要不是很大的二级结构改变一般不至于影响翻译过程。你可以检测一下工程细胞中翻译起始因子eIF4A,eIF4B是否都正常表达，若没有足量的eIF4A，那么mRNA的二级结构二级结构改变可能足以引起表达障碍，若没有足量的eIF4B，那么eIF4A足量表达eIF4A的效率也会很低。
另外，我觉得你该查一下工程细胞的目的蛋白质突变后是不是影响了它与别的蛋白质或DNA特异性片段之间的专一性结合，比如说它原本与某种转录因子又结合，但是突变后使该结合失效。
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6楼2012-04-23 22:10:03
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