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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 引物设计
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happywyh

铁虫 (小有名气)

[交流] 引物设计

上游1（含信号肽） 5’—3’ TTGATCATGATTACACGTC
上游2（不含信号肽） 5’—3’
下游  5’—3’ GATCATTGCAGGATCACTAA
引物设计的怎么样啊，用oligo，primer5分析里面数据太多，看不懂~~
oligo PCR分析（图1），得到的数据，觉得数据怪怪的，上下游引物退火温度差不多就好了，干嘛还有个product Tm呢，总结论也看不懂
上游引物二聚体分析：图2
下游引物二聚体分析：图3
上游错配分析：图4
看不懂，纠结~~还请各位赐教
引物分析时要不要把限制性酶碱基，保护碱基包括在内呀~

图一（PCR分析）



图2 上游引物二聚体分析



图3 下游引物二聚体分析



图4 上游引物错配率分析
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1楼 2012-03-26 17:09:46
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回帖置顶 ( 共有1个 )

atlanticwi

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
小丹木木: 金币+3, MolEPI+1, 只能说，非常感谢对本版的支持！ 2012-03-27 11:37:58
嗯.............要不这么来说说吧
1. 首先不明白你上游引物写了两个，为什么分析中只有一个，观察你的序列和引物位置，那么就假设你P的是某基因的CDS全长
2. 从PCR分析来看，两引物Tm值相差不大，但较不稳定引物与产物Tm值相差达到32.7度，这个比较致命，因为产物与引物Tm相差过高，会引起模板-模板间和模板-引物间的退火竞争效应，Oligo软件设计官方给出的最大差值是不要超过29度，也有人提出不要超过20度。所以要不增大你引物长度，适当增加引物Tm值，要不依旧使用此引物但采用高退火温度去P。
3. 以假定你是需要扩CDS来讲，那么上下游的Dimer实际并不用考虑过多，只要3‘Dimer不是很严重就可以了，文中观察你的Dimer中碱基配对数量和自由能观察，你这个引物基本木有问题。
4. 关于错配，Primer Premier5中是有错配是否能生成产物的结论，如果没有，怎么错配了我们都不管，或是错配产物远远小于P产物，那么我们也是不管，而Oligo好像是看上头Primering efficiency的，上游引物第一个与正义链的错配分数较高，但感觉也不会出现问题。
5. 再说明一下，需要另加的酶切位点和保护碱基是不算在引物分析之内的。
6. 以你就是要P某基因的CDS为例，反正正反开始都限定了，你就选个合适的引物长度去P就是了，注意长度要尽量长一点，保证高退火下的特异性就可以了。
纯属个人经验，不足之处或说错之处希望高手出现并指正，祝实验成功
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happywyh
3楼2012-03-26 22:33:37
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普通回帖

atlanticwi

金虫 (正式写手)
★
happywyh(金币+1): 谢谢参与
嗯............
引物设计来是做什么下游分析呢
先回答你的第三个问题，分析时不用管酶切位点及保护碱基，只管结合与模板的部分
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2楼2012-03-26 17:25:23
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yjb3344

木虫 (正式写手)
★
happywyh(金币+1): 谢谢参与
不怎么样……
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4楼2012-03-27 08:48:26
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happywyh

铁虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-03-26 22:33:37:
嗯.............要不这么来说说吧
1. 首先不明白你上游引物写了两个，为什么分析中只有一个，观察你的序列和引物位置，那么就假设你P的是某基因的CDS全长
2. 从PCR分析来看，两引物Tm值相差不大，但较不稳定引物 ...

谢谢~~帮助很大
根据所提的一些要点，我重新设计了两条引物
上游1（含有信号肽）AAAAAGAACCTGATCATGATTACACGTC
上游2（不含有信号肽）AGCTTTCCCATCTAGTATTCAA
下游 GATCATTGCAGGATCACTAAAGGAG
上游1：从起始密码子之前的15个碱基开始设计的
上游2：不含信号肽的部分不好设计，链短退火温度低，链长会严重的形成3'端二聚体，
这一次的引物设计结果PCR分析数据：




[ Last edited by happywyh on 2012-3-27 at 10:37 ]
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5楼2012-03-27 10:35:13
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遇见之殇

金虫 (小有名气)
★
happywyh(金币+1): 谢谢参与
引用回帖:
5楼: Originally posted by happywyh at 2012-03-27 10:35:13:
谢谢~~帮助很大
根据所提的一些要点，我重新设计了两条引物
上游1（含有信号肽）AAAAAGAACCTGATCATGATTACACGTC
上游2（不含有信号肽）AGCTTTCCCATCTAGTATTCAA
下游 GATCATTGCAGGATCACTAAAGGAG
上游1： ...

我觉得这次的还不错
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6楼2012-03-27 12:50:15
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孙启亮

金虫 (著名写手)
★
happywyh(金币+1): 谢谢参与
建议楼主同时做下primer-blast，看能不能扩出来自己想要的片段，网址为http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tool ... ?LINK_LOC=BlastHome 我刚刚帮你blast了一下，发现什么产物也没有
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7楼2012-03-27 13:18:08
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happywyh

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 孙启亮 at 2012-03-27 13:18:08:
建议楼主同时做下primer-blast，看能不能扩出来自己想要的片段，网址为http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome 我刚刚帮你blast了一下，发现什么产物也没有

没有模板怎么blast一下？
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8楼2012-03-27 21:17:50
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孙启亮

金虫 (著名写手)
★ ★
西瓜: 金币+2, Good! 2012-03-28 10:12:47
引用回帖:
8楼: Originally posted by happywyh at 2012-03-27 21:17:50:
没有模板怎么blast一下？

引物的blast不需要模板，比如说假如你想扩人IL6，那么把你的引物进行blast后NCBI会告诉你理论上你的引物是否能扩出IL6，同时也会告诉你你的引物能不能扩出除了IL6以外的其他东西，也就是引物的特异性问题
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happywyh
9楼2012-03-27 22:33:35
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happywyh

铁虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
9楼: Originally posted by 孙启亮 at 2012-03-27 22:33:35:
引物的blast不需要模板，比如说假如你想扩人IL6，那么把你的引物进行blast后NCBI会告诉你理论上你的引物是否能扩出IL6，同时也会告诉你你的引物能不能扩出除了IL6以外的其他东西，也就是引物的特异性问题

包含保护碱基和酶切位点的上下引物blast不出任何特异性的产物
不含保护碱基和酶切位点的上下游引物可以特异性的blast出产物
不知道这其中有什么关联
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10楼2012-03-28 15:30:16
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