应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 引物设计
101/1返回列表
查看: 2543  |  回复: 9
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
本帖产生 1 个 MolEPI ，点击这里进行查看

happywyh

铁虫 (小有名气)

[交流] 引物设计

上游1（含信号肽） 5’—3’ TTGATCATGATTACACGTC
上游2（不含信号肽） 5’—3’
下游  5’—3’ GATCATTGCAGGATCACTAA
引物设计的怎么样啊，用oligo，primer5分析里面数据太多，看不懂~~
oligo PCR分析（图1），得到的数据，觉得数据怪怪的，上下游引物退火温度差不多就好了，干嘛还有个product Tm呢，总结论也看不懂
上游引物二聚体分析：图2
下游引物二聚体分析：图3
上游错配分析：图4
看不懂，纠结~~还请各位赐教
引物分析时要不要把限制性酶碱基，保护碱基包括在内呀~

图一（PCR分析）



图2 上游引物二聚体分析



图3 下游引物二聚体分析



图4 上游引物错配率分析
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

分子生物学资料 分子生物 【分子生物】EPI帖 分子生物实验相关
分子生物

» 猜你喜欢

» 抢金币啦！回帖就可以得到:

查看全部散金贴
1楼 2012-03-26 17:09:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖置顶 ( 共有1个 )

atlanticwi

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
小丹木木: 金币+3, MolEPI+1, 只能说，非常感谢对本版的支持！ 2012-03-27 11:37:58
嗯.............要不这么来说说吧
1. 首先不明白你上游引物写了两个，为什么分析中只有一个，观察你的序列和引物位置，那么就假设你P的是某基因的CDS全长
2. 从PCR分析来看，两引物Tm值相差不大，但较不稳定引物与产物Tm值相差达到32.7度，这个比较致命，因为产物与引物Tm相差过高，会引起模板-模板间和模板-引物间的退火竞争效应，Oligo软件设计官方给出的最大差值是不要超过29度，也有人提出不要超过20度。所以要不增大你引物长度，适当增加引物Tm值，要不依旧使用此引物但采用高退火温度去P。
3. 以假定你是需要扩CDS来讲，那么上下游的Dimer实际并不用考虑过多，只要3‘Dimer不是很严重就可以了，文中观察你的Dimer中碱基配对数量和自由能观察，你这个引物基本木有问题。
4. 关于错配，Primer Premier5中是有错配是否能生成产物的结论，如果没有，怎么错配了我们都不管，或是错配产物远远小于P产物，那么我们也是不管，而Oligo好像是看上头Primering efficiency的，上游引物第一个与正义链的错配分数较高，但感觉也不会出现问题。
5. 再说明一下，需要另加的酶切位点和保护碱基是不算在引物分析之内的。
6. 以你就是要P某基因的CDS为例，反正正反开始都限定了，你就选个合适的引物长度去P就是了，注意长度要尽量长一点，保证高退火下的特异性就可以了。
纯属个人经验，不足之处或说错之处希望高手出现并指正，祝实验成功
赞一下 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

happywyh
3楼2012-03-26 22:33:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

atlanticwi

金虫 (正式写手)
★
happywyh(金币+1): 谢谢参与
嗯............
引物设计来是做什么下游分析呢
先回答你的第三个问题，分析时不用管酶切位点及保护碱基，只管结合与模板的部分
赞一下 回复此楼
2楼2012-03-26 17:25:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yjb3344

木虫 (正式写手)
★
happywyh(金币+1): 谢谢参与
不怎么样……
回复此楼
4楼2012-03-27 08:48:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

happywyh

铁虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-03-26 22:33:37:
嗯.............要不这么来说说吧
1. 首先不明白你上游引物写了两个，为什么分析中只有一个，观察你的序列和引物位置，那么就假设你P的是某基因的CDS全长
2. 从PCR分析来看，两引物Tm值相差不大，但较不稳定引物 ...

谢谢~~帮助很大
根据所提的一些要点，我重新设计了两条引物
上游1（含有信号肽）AAAAAGAACCTGATCATGATTACACGTC
上游2（不含有信号肽）AGCTTTCCCATCTAGTATTCAA
下游 GATCATTGCAGGATCACTAAAGGAG
上游1：从起始密码子之前的15个碱基开始设计的
上游2：不含信号肽的部分不好设计，链短退火温度低，链长会严重的形成3'端二聚体，
这一次的引物设计结果PCR分析数据：




[ Last edited by happywyh on 2012-3-27 at 10:37 ]
赞一下 回复此楼
5楼2012-03-27 10:35:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

遇见之殇

金虫 (小有名气)
★
happywyh(金币+1): 谢谢参与
引用回帖:
5楼: Originally posted by happywyh at 2012-03-27 10:35:13:
谢谢~~帮助很大
根据所提的一些要点，我重新设计了两条引物
上游1（含有信号肽）AAAAAGAACCTGATCATGATTACACGTC
上游2（不含有信号肽）AGCTTTCCCATCTAGTATTCAA
下游 GATCATTGCAGGATCACTAAAGGAG
上游1： ...

我觉得这次的还不错
赞一下 回复此楼
6楼2012-03-27 12:50:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

孙启亮

金虫 (著名写手)
★
happywyh(金币+1): 谢谢参与
建议楼主同时做下primer-blast，看能不能扩出来自己想要的片段，网址为http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tool ... ?LINK_LOC=BlastHome 我刚刚帮你blast了一下，发现什么产物也没有
赞一下 回复此楼
7楼2012-03-27 13:18:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

happywyh

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 孙启亮 at 2012-03-27 13:18:08:
建议楼主同时做下primer-blast，看能不能扩出来自己想要的片段，网址为http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome 我刚刚帮你blast了一下，发现什么产物也没有

没有模板怎么blast一下？
赞一下 回复此楼
8楼2012-03-27 21:17:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

孙启亮

金虫 (著名写手)
★ ★
西瓜: 金币+2, Good! 2012-03-28 10:12:47
引用回帖:
8楼: Originally posted by happywyh at 2012-03-27 21:17:50:
没有模板怎么blast一下？

引物的blast不需要模板，比如说假如你想扩人IL6，那么把你的引物进行blast后NCBI会告诉你理论上你的引物是否能扩出IL6，同时也会告诉你你的引物能不能扩出除了IL6以外的其他东西，也就是引物的特异性问题
赞一下 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

happywyh
9楼2012-03-27 22:33:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

happywyh

铁虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
9楼: Originally posted by 孙启亮 at 2012-03-27 22:33:35:
引物的blast不需要模板，比如说假如你想扩人IL6，那么把你的引物进行blast后NCBI会告诉你理论上你的引物是否能扩出IL6，同时也会告诉你你的引物能不能扩出除了IL6以外的其他东西，也就是引物的特异性问题

包含保护碱基和酶切位点的上下引物blast不出任何特异性的产物
不含保护碱基和酶切位点的上下游引物可以特异性的blast出产物
不知道这其中有什么关联
赞一下 回复此楼
10楼2012-03-28 15:30:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 happywyh 的主题更新
101/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 河北省自然科学基金 +5 Peterchao 2026-05-18 8/400 2026-05-24 11:58 by 晓晓爱翠翠
[基金申请] 西安交大新媒学院副院长用撤稿论文结题 +3 bjvtcliu 2026-05-24 5/250 2026-05-24 10:16 by kudofaye
[教师之家] 论文撤稿了 +3 bjvtcliu 2026-05-24 5/250 2026-05-24 10:06 by Equinoxhua
[教师之家] 某211大学教师把个人教师官方主页改成:我跑了我跑了我跑了!官宣跑路！ +4 zju2000 2026-05-21 5/250 2026-05-24 09:35 by songwz
[考博] 26/27申博自荐 10+4 ZXW0202 2026-05-22 9/450 2026-05-24 08:47 by bjvtcliu
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.5.5.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +3 hvkbtfonbv 2026-05-23 3/150 2026-05-24 08:01 by 9ps9vgkqva
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.5.5.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +3 pmo95bazuy 2026-05-23 7/350 2026-05-24 06:35 by fpo5ljpv91
[基金申请] 揭秘青基评审内幕：几个A才能顺利中标 +3 国自然国社科中 2026-05-23 4/200 2026-05-23 15:37 by 2000zf36392
[基金申请] 青B发送上会通知了吗 +5 chemBioBro 2026-05-22 7/350 2026-05-23 12:35 by zhuifengzhy
[考博] 博士申请 +3 焦晓明 2026-05-21 3/150 2026-05-23 11:26 by mlc840311
[论文投稿] 投稿求助，期刊 +4 希冀，有书读 2026-05-20 8/400 2026-05-22 10:16 by 希冀，有书读
[文学芳草园] 献血感触 +7 呀呀好傻 2026-05-19 13/650 2026-05-21 20:15 by 呀呀好傻
[基金申请] 面上本子正文33页，违规吗？会被低分嘛？ +14 1234567wang 2026-05-17 16/800 2026-05-21 17:58 by 脆脆的饼干
[基金申请] 国自然评分 +4 无名者登山 2026-05-20 5/250 2026-05-21 16:35 by swuq
[基金申请] 国自然上会要求 +7 无名者登山 2026-05-18 11/550 2026-05-21 15:50 by draco1987
[基金申请] 提交了我也来说说感想 +9 fummck 2026-05-20 10/500 2026-05-21 14:17 by draco1987
[有机交流] 反应很差，大量原料没有反应 5+3 Mr.Zot 2026-05-19 8/400 2026-05-20 22:19 by Equinoxhua
[考博] 如果工作了想读博，可以边工作边读全日制嘛？ 30+3 铁达火车 2026-05-18 5/250 2026-05-20 09:33 by tfang
[考博] 博士申请 +5 星…… 2026-05-18 6/300 2026-05-18 23:49 by 糊糊涂涂好
[硕博家园] 我在等一个没有答案的答案 +3 Love_MH 2026-05-17 3/150 2026-05-18 02:22 by 竹林孤影
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭