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引物设计
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上游1（含信号肽） 5’—3’ TTGATCATGATTACACGTC 上游2（不含信号肽） 5’—3’ 下游 5’—3’ GATCATTGCAGGATCACTAA 引物设计的怎么样啊，用oligo，primer5分析里面数据太多，看不懂~~ oligo PCR分析（图1），得到的数据，觉得数据怪怪的，上下游引物退火温度差不多就好了，干嘛还有个product Tm呢，总结论也看不懂 上游引物二聚体分析：图2 下游引物二聚体分析：图3 上游错配分析：图4 看不懂，纠结~~还请各位赐教 引物分析时要不要把限制性酶碱基，保护碱基包括在内呀~  图一（PCR分析）  图2 上游引物二聚体分析  图3 下游引物二聚体分析  图4 上游引物错配率分析 |
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小丹木木: 金币+3, MolEPI+1, 只能说，非常感谢对本版的支持！ 2012-03-27 11:37:58
小丹木木: 金币+3, MolEPI+1, 只能说，非常感谢对本版的支持！ 2012-03-27 11:37:58
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嗯.............要不这么来说说吧 1. 首先不明白你上游引物写了两个，为什么分析中只有一个，观察你的序列和引物位置，那么就假设你P的是某基因的CDS全长 2. 从PCR分析来看，两引物Tm值相差不大，但较不稳定引物与产物Tm值相差达到32.7度，这个比较致命，因为产物与引物Tm相差过高，会引起模板-模板间和模板-引物间的退火竞争效应，Oligo软件设计官方给出的最大差值是不要超过29度，也有人提出不要超过20度。所以要不增大你引物长度，适当增加引物Tm值，要不依旧使用此引物但采用高退火温度去P。 3. 以假定你是需要扩CDS来讲，那么上下游的Dimer实际并不用考虑过多，只要3‘Dimer不是很严重就可以了，文中观察你的Dimer中碱基配对数量和自由能观察，你这个引物基本木有问题。 4. 关于错配，Primer Premier5中是有错配是否能生成产物的结论，如果没有，怎么错配了我们都不管，或是错配产物远远小于P产物，那么我们也是不管，而Oligo好像是看上头Primering efficiency的，上游引物第一个与正义链的错配分数较高，但感觉也不会出现问题。 5. 再说明一下，需要另加的酶切位点和保护碱基是不算在引物分析之内的。 6. 以你就是要P某基因的CDS为例，反正正反开始都限定了，你就选个合适的引物长度去P就是了，注意长度要尽量长一点，保证高退火下的特异性就可以了。 纯属个人经验，不足之处或说错之处希望高手出现并指正，祝实验成功  |
happywyh3楼2012-03-26 22:33:37
2楼2012-03-26 17:25:23
5楼2012-03-27 10:35:13
6楼2012-03-27 12:50:15