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atlanticwi

金虫 (正式写手)


★ ★ ★
小丹木木: 金币+3, MolEPI+1, 只能说,非常感谢对本版的支持! 2012-03-27 11:37:58
嗯.............要不这么来说说吧
1. 首先不明白你上游引物写了两个,为什么分析中只有一个,观察你的序列和引物位置,那么就假设你P的是某基因的CDS全长
2. 从PCR分析来看,两引物Tm值相差不大,但较不稳定引物与产物Tm值相差达到32.7度,这个比较致命,因为产物与引物Tm相差过高,会引起模板-模板间和模板-引物间的退火竞争效应,Oligo软件设计官方给出的最大差值是不要超过29度,也有人提出不要超过20度。所以要不增大你引物长度,适当增加引物Tm值,要不依旧使用此引物但采用高退火温度去P。
3. 以假定你是需要扩CDS来讲,那么上下游的Dimer实际并不用考虑过多,只要3‘Dimer不是很严重就可以了,文中观察你的Dimer中碱基配对数量和自由能观察,你这个引物基本木有问题。
4. 关于错配,Primer Premier5中是有错配是否能生成产物的结论,如果没有,怎么错配了我们都不管,或是错配产物远远小于P产物,那么我们也是不管,而Oligo好像是看上头Primering efficiency的,上游引物第一个与正义链的错配分数较高,但感觉也不会出现问题。
5. 再说明一下,需要另加的酶切位点和保护碱基是不算在引物分析之内的。
6. 以你就是要P某基因的CDS为例,反正正反开始都限定了,你就选个合适的引物长度去P就是了,注意长度要尽量长一点,保证高退火下的特异性就可以了。
纯属个人经验,不足之处或说错之处希望高手出现并指正,祝实验成功

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3楼2012-03-26 22:33:37
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