应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 引物设计
51/1返回列表
查看: 2359  |  回复: 9
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
本帖产生 1 个 MolEPI ，点击这里进行查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

happywyh

铁虫 (小有名气)

[交流] 引物设计

上游1（含信号肽） 5’—3’ TTGATCATGATTACACGTC
上游2（不含信号肽） 5’—3’
下游  5’—3’ GATCATTGCAGGATCACTAA
引物设计的怎么样啊，用oligo，primer5分析里面数据太多，看不懂~~
oligo PCR分析（图1），得到的数据，觉得数据怪怪的，上下游引物退火温度差不多就好了，干嘛还有个product Tm呢，总结论也看不懂
上游引物二聚体分析：图2
下游引物二聚体分析：图3
上游错配分析：图4
看不懂，纠结~~还请各位赐教
引物分析时要不要把限制性酶碱基，保护碱基包括在内呀~

图一（PCR分析）



图2 上游引物二聚体分析



图3 下游引物二聚体分析



图4 上游引物错配率分析
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

分子生物学资料 分子生物 【分子生物】EPI帖 分子生物实验相关
分子生物

» 猜你喜欢

» 抢金币啦！回帖就可以得到:

查看全部散金贴
1楼 2012-03-26 17:09:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

孙启亮

金虫 (著名写手)
★
happywyh(金币+1): 谢谢参与
建议楼主同时做下primer-blast，看能不能扩出来自己想要的片段，网址为http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tool ... ?LINK_LOC=BlastHome 我刚刚帮你blast了一下，发现什么产物也没有
赞一下 回复此楼
7楼2012-03-27 13:18:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 10 个回答

atlanticwi

金虫 (正式写手)
★
happywyh(金币+1): 谢谢参与
嗯............
引物设计来是做什么下游分析呢
先回答你的第三个问题，分析时不用管酶切位点及保护碱基，只管结合与模板的部分
赞一下 回复此楼
2楼2012-03-26 17:25:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

atlanticwi

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
小丹木木: 金币+3, MolEPI+1, 只能说，非常感谢对本版的支持！ 2012-03-27 11:37:58
嗯.............要不这么来说说吧
1. 首先不明白你上游引物写了两个，为什么分析中只有一个，观察你的序列和引物位置，那么就假设你P的是某基因的CDS全长
2. 从PCR分析来看，两引物Tm值相差不大，但较不稳定引物与产物Tm值相差达到32.7度，这个比较致命，因为产物与引物Tm相差过高，会引起模板-模板间和模板-引物间的退火竞争效应，Oligo软件设计官方给出的最大差值是不要超过29度，也有人提出不要超过20度。所以要不增大你引物长度，适当增加引物Tm值，要不依旧使用此引物但采用高退火温度去P。
3. 以假定你是需要扩CDS来讲，那么上下游的Dimer实际并不用考虑过多，只要3‘Dimer不是很严重就可以了，文中观察你的Dimer中碱基配对数量和自由能观察，你这个引物基本木有问题。
4. 关于错配，Primer Premier5中是有错配是否能生成产物的结论，如果没有，怎么错配了我们都不管，或是错配产物远远小于P产物，那么我们也是不管，而Oligo好像是看上头Primering efficiency的，上游引物第一个与正义链的错配分数较高，但感觉也不会出现问题。
5. 再说明一下，需要另加的酶切位点和保护碱基是不算在引物分析之内的。
6. 以你就是要P某基因的CDS为例，反正正反开始都限定了，你就选个合适的引物长度去P就是了，注意长度要尽量长一点，保证高退火下的特异性就可以了。
纯属个人经验，不足之处或说错之处希望高手出现并指正，祝实验成功
赞一下 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

happywyh
3楼2012-03-26 22:33:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

happywyh

铁虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-03-26 22:33:37:
嗯.............要不这么来说说吧
1. 首先不明白你上游引物写了两个，为什么分析中只有一个，观察你的序列和引物位置，那么就假设你P的是某基因的CDS全长
2. 从PCR分析来看，两引物Tm值相差不大，但较不稳定引物 ...

谢谢~~帮助很大
根据所提的一些要点，我重新设计了两条引物
上游1（含有信号肽）AAAAAGAACCTGATCATGATTACACGTC
上游2（不含有信号肽）AGCTTTCCCATCTAGTATTCAA
下游 GATCATTGCAGGATCACTAAAGGAG
上游1：从起始密码子之前的15个碱基开始设计的
上游2：不含信号肽的部分不好设计，链短退火温度低，链长会严重的形成3'端二聚体，
这一次的引物设计结果PCR分析数据：




[ Last edited by happywyh on 2012-3-27 at 10:37 ]
赞一下 回复此楼
5楼2012-03-27 10:35:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 10 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭