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decloud

木虫 (著名写手)

[求助] 如何导将ApaI酶切位点变成EcoRI

我有一段序列在3‘端的酶切位点是ApaI, 我想把这个酶位点覆盖变成EcoRI,
有没有高手指点啊,别人跟我说可以在这个位点后面导入新的位点,但是ApaI会影响我将来的实验,我不想保留这个ApaI,
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适则存乙,劳则忙乙,
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taxuan

新虫 (初入文坛)

★ ★ ★
西瓜: 金币+3, 新虫特别奖励~欢迎常来! 2012-03-19 11:47:13
可以这样,先将基因上的这个酶切位点切掉,再设计一个带EcoRI的接头与之连接就好了!
2楼2012-03-18 21:06:24
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taxuan

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
可以这样,先将基因上的这个酶切位点切掉,再设计一个带EcoRI的接头与之连接就好了!
3楼2012-03-18 21:07:53
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shaquila

金虫 (正式写手)

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励 2012-03-19 10:04:59
楼主,这个很简单,是否保留看你决定,因为是粘端酶切位点,当用apal切的时候会产生5突的粘端,用带ecor1的接头连接,但是互补接头用compatible end,不要用apa1的反向重复序列。这样apa就消失了。
4楼2012-03-18 22:32:43
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decloud

木虫 (著名写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by shaquila at 2012-03-18 02:32:43:
楼主,这个很简单,是否保留看你决定,因为是粘端酶切位点,当用apal切的时候会产生5突的粘端,用带ecor1的接头连接,但是互补接头用compatible end,不要用apa1的反向重复序列。这样apa就消失了。

但是这个compatible end 需要怎么设计呢。我是第一做这个,谢谢
适则存乙,劳则忙乙,
5楼2012-03-19 07:18:26
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shaquila

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
西瓜: 金币+5, MolEPI+1, Good! 2012-03-19 11:47:46
decloud: 金币+5, ★★★★★最佳答案, 可不可以直接设计新的引物,然后pcr来取代ApaI为点. 2012-03-19 12:12:02
举个例子。GGGCCC酶切位点
切完后为5‘G
             3'CCCGG

你的接头应该为
        5‘GGCCC  +EcoRI
                     3'G
这样互补后就是apa1位点+ecorI位点

如果你修改为
        5‘GGCCA +EcoRI
                     3'T
这样ApaI就消失了
6楼2012-03-19 11:33:39
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shaquila

金虫 (正式写手)

如果直接用pcr可以的,但是如果是载体就,片段太大,效率不高。
7楼2012-03-19 18:38:34
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decloud

木虫 (著名写手)

引用回帖:
7楼: Originally posted by shaquila at 2012-03-18 22:38:34:
如果直接用pcr可以的,但是如果是载体就,片段太大,效率不高。

PCR也就500多bp吧,
如果直接涉及comtabile end的引物, 好像还涉及到一个5' end的磷酸化,貌似磷酸化了以后才可以ligation.

这个5' end 磷酸化要怎么弄呢...再次谢谢
适则存乙,劳则忙乙,
8楼2012-03-20 03:21:56
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XOooZzz

银虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by decloud at 2012-03-20 03:21:56:
PCR也就500多bp吧,
如果直接涉及comtabile end的引物, 好像还涉及到一个5' end的磷酸化,貌似磷酸化了以后才可以ligation.

这个5' end 磷酸化要怎么弄呢...再次谢谢

如果接头有20来个bp以上的话,不磷酸化也是没有问题的,只要保证有部分质粒连接后没有线性化,就可以转化细菌。
9楼2012-03-20 10:48:36
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