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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 如何导将ApaI酶切位点变成EcoRI
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decloud

木虫 (著名写手)

[求助] 如何导将ApaI酶切位点变成EcoRI

我有一段序列在3‘端的酶切位点是ApaI， 我想把这个酶位点覆盖变成EcoRI，
有没有高手指点啊，别人跟我说可以在这个位点后面导入新的位点，但是ApaI会影响我将来的实验，我不想保留这个ApaI，
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适则存乙，劳则忙乙，
1楼 2012-03-18 15:36:43
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taxuan

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★
西瓜: 金币+3, 新虫特别奖励~欢迎常来！ 2012-03-19 11:47:13
可以这样，先将基因上的这个酶切位点切掉，再设计一个带EcoRI的接头与之连接就好了！
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2楼2012-03-18 21:06:24
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taxuan

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可以这样，先将基因上的这个酶切位点切掉，再设计一个带EcoRI的接头与之连接就好了！
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3楼2012-03-18 21:07:53
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shaquila

金虫 (正式写手)
★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励 2012-03-19 10:04:59
楼主，这个很简单，是否保留看你决定，因为是粘端酶切位点，当用apal切的时候会产生5突的粘端，用带ecor1的接头连接，但是互补接头用compatible end，不要用apa1的反向重复序列。这样apa就消失了。
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4楼2012-03-18 22:32:43
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decloud

木虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by shaquila at 2012-03-18 02:32:43:
楼主，这个很简单，是否保留看你决定，因为是粘端酶切位点，当用apal切的时候会产生5突的粘端，用带ecor1的接头连接，但是互补接头用compatible end，不要用apa1的反向重复序列。这样apa就消失了。

但是这个compatible end 需要怎么设计呢。我是第一做这个，谢谢
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适则存乙，劳则忙乙，
5楼2012-03-19 07:18:26
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shaquila

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+5, MolEPI+1, Good！ 2012-03-19 11:47:46
decloud: 金币+5, ★★★★★最佳答案, 可不可以直接设计新的引物,然后pcr来取代ApaI为点. 2012-03-19 12:12:02
举个例子。GGGCCC酶切位点
切完后为5‘G
             3'CCCGG

你的接头应该为
        5‘GGCCC  +EcoRI
                     3'G
这样互补后就是apa1位点+ecorI位点

如果你修改为
        5‘GGCCA +EcoRI
                     3'T
这样ApaI就消失了
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6楼2012-03-19 11:33:39
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shaquila

金虫 (正式写手)
如果直接用pcr可以的，但是如果是载体就，片段太大，效率不高。
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7楼2012-03-19 18:38:34
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decloud

木虫 (著名写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by shaquila at 2012-03-18 22:38:34:
如果直接用pcr可以的，但是如果是载体就，片段太大，效率不高。

PCR也就500多bp吧,
如果直接涉及comtabile end的引物, 好像还涉及到一个5' end的磷酸化,貌似磷酸化了以后才可以ligation.

这个5' end 磷酸化要怎么弄呢...再次谢谢
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适则存乙，劳则忙乙，
8楼2012-03-20 03:21:56
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XOooZzz

银虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by decloud at 2012-03-20 03:21:56:
PCR也就500多bp吧,
如果直接涉及comtabile end的引物, 好像还涉及到一个5' end的磷酸化,貌似磷酸化了以后才可以ligation.

这个5' end 磷酸化要怎么弄呢...再次谢谢

如果接头有20来个bp以上的话，不磷酸化也是没有问题的，只要保证有部分质粒连接后没有线性化，就可以转化细菌。
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9楼2012-03-20 10:48:36
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