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[求助]
求助蛋白纯化的高手
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| 我现在真核表达一个蛋白，蛋白分泌到培养基的上清中，准备用DMEM培养，2%FBS.目的蛋白的分子量是22KD，等电点是9.2，有没有高手能帮我设计一个纯化的步骤呀！该蛋白没有标签，想直接用亲和层析，用该蛋白的抗体制备能行吗？ |
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5楼2012-03-15 10:48:54
疯狂修行者
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
西瓜(金币+3): Good！ 2012-03-14 22:20:55
yuanalice: 金币+15, ★★★很有帮助 2012-03-15 10:48:05
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yuanalice: 金币+15, ★★★很有帮助 2012-03-15 10:48:05
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（1）加入NaOH溶液调pH值到9-10 （2）4度8000转离心约10分钟，取上清： （3）按照1比7的比例加入4M NaAc溶液，利用HAc调pH值至4.5-5.0 4M NaAc溶液： 分子量 质量 总体积 4M NaAc 82.07 65.61g 200mL （用HAc调pH值至4.5，先用少量的水（约50mL）溶解NaAc,然后加入HAc至pH5.3左右，稀释10测定pH值（取0.5mL溶液加水稀释至5mL测定pH值，）用HAc调节原NaAc溶液使得稀释10后的溶液pH值至4.5） （4）4℃下，沉淀6-8h （沉淀时间可以根据实验安排适当调整至更长，不可低于6h） （5）4℃下，12000rpm离心15min，收集沉淀 （6）用预冷无菌水洗涤沉淀2次，4℃下，12000rpm离心15min （7）沉淀溶于50 mM的Na2CO3溶解，1M NaOH调节pH值至9.5-10.0 （注意: 加入体积为1L菌液溶于10mL Na2CO3溶液。若晶体蛋白降解可加入150 mM的PMSF）。 |
2楼2012-03-14 20:07:59
lihuan0525
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3楼2012-03-14 22:48:41
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