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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助蛋白纯化的高手
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yuanalice

银虫 (小有名气)

[求助] 求助蛋白纯化的高手

我现在真核表达一个蛋白，蛋白分泌到培养基的上清中，准备用DMEM培养，2%FBS.目的蛋白的分子量是22KD，等电点是9.2，有没有高手能帮我设计一个纯化的步骤呀！该蛋白没有标签，想直接用亲和层析，用该蛋白的抗体制备能行吗？
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1楼 2012-03-14 18:06:41
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疯狂修行者

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜(金币+3): Good！ 2012-03-14 22:20:55
yuanalice: 金币+15, ★★★很有帮助 2012-03-15 10:48:05
（1）加入NaOH溶液调pH值到9-10
（2）4度8000转离心约10分钟，取上清：
（3）按照1比7的比例加入4M NaAc溶液，利用HAc调pH值至4.5-5.0
4M NaAc溶液：
分子量          质量           总体积
4M NaAc         82.07           65.61g           200mL
（用HAc调pH值至4.5，先用少量的水（约50mL）溶解NaAc,然后加入HAc至pH5.3左右，稀释10测定pH值（取0.5mL溶液加水稀释至5mL测定pH值，）用HAc调节原NaAc溶液使得稀释10后的溶液pH值至4.5）
（4）4℃下，沉淀6-8h
     （沉淀时间可以根据实验安排适当调整至更长，不可低于6h）
（5）4℃下，12000rpm离心15min，收集沉淀
（6）用预冷无菌水洗涤沉淀2次，4℃下，12000rpm离心15min
（7）沉淀溶于50 mM的Na2CO3溶解，1M NaOH调节pH值至9.5-10.0
（注意: 加入体积为1L菌液溶于10mL Na2CO3溶液。若晶体蛋白降解可加入150 mM的PMSF）。
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戒骄戒躁，坦荡做人，平常心做事，享受生活之美！！
2楼2012-03-14 20:07:59
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lihuan0525

金虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
yuanalice: 金币+2 2012-03-15 10:49:04
不知道你那边是公司还是啊，如果是公司的话，我可以找个朋友帮你设计，并且条件也给你摸索，但是你得买他们的填料。
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3楼2012-03-14 22:48:41
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yuanalice

银虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by 疯狂修行者 at 2012-03-14 20:07:59:
（1）加入NaOH溶液调pH值到9-10
（2）4度8000转离心约10分钟，取上清：
（3）按照1比7的比例加入4M NaAc溶液，利用HAc调pH值至4.5-5.0
4M NaAc溶液：
分子量          质量           总体积
4M NaAc        ...

这位高手很感谢，就是想再问问这样会不会对蛋白活性影响较大呢，应为这个蛋白后期还在检测活性呢，而且重头就是要看活性，有没有其他温和一些的纯化办法呢
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4楼2012-03-15 10:47:54
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yuanalice

银虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by lihuan0525 at 2012-03-14 22:48:41:
不知道你那边是公司还是啊，如果是公司的话，我可以找个朋友帮你设计，并且条件也给你摸索，但是你得买他们的填料。

不好意思，我是在实验室做的。
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5楼2012-03-15 10:48:54
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SPMMP

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+3, Good! 2012-03-28 10:11:42
yuanalice: 金币+3 2012-04-09 10:26:14
建议首先将上清液用30 kDa截留的膜浓缩，目的蛋白的分子量是22 kDa，进入外液而FBS因分子量较大在内液。接下来，将外液用10 kDa截留的膜浓缩。这时，目的蛋白在内液，而小分子量物质被排出到外液。将浓缩的内液过凝胶过滤，应可得到较高纯度的目的蛋白，而且生物活性不会有太大损失。
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6楼2012-03-27 22:07:07
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