应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助蛋白纯化的高手
61/1返回列表
查看: 1812  |  回复: 5
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

yuanalice

银虫 (小有名气)

[求助] 求助蛋白纯化的高手

我现在真核表达一个蛋白，蛋白分泌到培养基的上清中，准备用DMEM培养，2%FBS.目的蛋白的分子量是22KD，等电点是9.2，有没有高手能帮我设计一个纯化的步骤呀！该蛋白没有标签，想直接用亲和层析，用该蛋白的抗体制备能行吗？
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2012-03-14 18:06:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

疯狂修行者

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜(金币+3): Good！ 2012-03-14 22:20:55
yuanalice: 金币+15, ★★★很有帮助 2012-03-15 10:48:05
（1）加入NaOH溶液调pH值到9-10
（2）4度8000转离心约10分钟，取上清：
（3）按照1比7的比例加入4M NaAc溶液，利用HAc调pH值至4.5-5.0
4M NaAc溶液：
分子量          质量           总体积
4M NaAc         82.07           65.61g           200mL
（用HAc调pH值至4.5，先用少量的水（约50mL）溶解NaAc,然后加入HAc至pH5.3左右，稀释10测定pH值（取0.5mL溶液加水稀释至5mL测定pH值，）用HAc调节原NaAc溶液使得稀释10后的溶液pH值至4.5）
（4）4℃下，沉淀6-8h
     （沉淀时间可以根据实验安排适当调整至更长，不可低于6h）
（5）4℃下，12000rpm离心15min，收集沉淀
（6）用预冷无菌水洗涤沉淀2次，4℃下，12000rpm离心15min
（7）沉淀溶于50 mM的Na2CO3溶解，1M NaOH调节pH值至9.5-10.0
（注意: 加入体积为1L菌液溶于10mL Na2CO3溶液。若晶体蛋白降解可加入150 mM的PMSF）。
赞一下 回复此楼
戒骄戒躁，坦荡做人，平常心做事，享受生活之美！！
2楼2012-03-14 20:07:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lihuan0525

金虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
yuanalice: 金币+2 2012-03-15 10:49:04
不知道你那边是公司还是啊，如果是公司的话，我可以找个朋友帮你设计，并且条件也给你摸索，但是你得买他们的填料。
赞一下 回复此楼
3楼2012-03-14 22:48:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yuanalice

银虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by 疯狂修行者 at 2012-03-14 20:07:59:
（1）加入NaOH溶液调pH值到9-10
（2）4度8000转离心约10分钟，取上清：
（3）按照1比7的比例加入4M NaAc溶液，利用HAc调pH值至4.5-5.0
4M NaAc溶液：
分子量          质量           总体积
4M NaAc        ...

这位高手很感谢，就是想再问问这样会不会对蛋白活性影响较大呢，应为这个蛋白后期还在检测活性呢，而且重头就是要看活性，有没有其他温和一些的纯化办法呢
赞一下 回复此楼
4楼2012-03-15 10:47:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yuanalice

银虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by lihuan0525 at 2012-03-14 22:48:41:
不知道你那边是公司还是啊，如果是公司的话，我可以找个朋友帮你设计，并且条件也给你摸索，但是你得买他们的填料。

不好意思，我是在实验室做的。
赞一下 回复此楼
5楼2012-03-15 10:48:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

SPMMP

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+3, Good! 2012-03-28 10:11:42
yuanalice: 金币+3 2012-04-09 10:26:14
建议首先将上清液用30 kDa截留的膜浓缩，目的蛋白的分子量是22 kDa，进入外液而FBS因分子量较大在内液。接下来，将外液用10 kDa截留的膜浓缩。这时，目的蛋白在内液，而小分子量物质被排出到外液。将浓缩的内液过凝胶过滤，应可得到较高纯度的目的蛋白，而且生物活性不会有太大损失。
赞一下 回复此楼
6楼2012-03-27 22:07:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 yuanalice 的主题更新
61/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 318求调剂 +5 李新光 2026-03-10 5/250 2026-03-17 11:02 by JineShine
[考研] 材料专硕274一志愿陕西师范大学求调剂 +5 薛云鹏 2026-03-13 5/250 2026-03-17 10:15 by Sammy2
[考研] 考研化学学硕调剂，一志愿985 +3 张vvvv 2026-03-15 5/250 2026-03-16 20:25 by 张vvvv
[考研] 333求调剂 +3 文思客 2026-03-16 7/350 2026-03-16 18:21 by 文思客
[考研] 一志愿985，本科211，0817化学工程与技术319求调剂 +5 Liwangman 2026-03-15 5/250 2026-03-16 17:10 by 我的船我的海
[基金申请] NSFC申报书里申请人简历中代表性论著还需要在申报书最后的附件里面再上传一遍吗 20+5 NSFC2026我来了 2026-03-10 14/700 2026-03-15 23:53 by 不负韶华的虎
[考研] 288求调剂 +4 奇点0314 2026-03-14 4/200 2026-03-14 23:04 by JourneyLucky
[考研] 080500，材料学硕302分求调剂学校 +4 初识可乐 2026-03-14 5/250 2026-03-14 21:08 by peike
[基金申请] 现在如何回避去年的某一个专家，不知道名字 +3 zk200107 2026-03-12 6/300 2026-03-14 17:13 by zk200107
[考研] 331求调剂（0703有机化学 +5 ZY-05 2026-03-13 6/300 2026-03-14 10:51 by Jy?
[考研] 求调剂，一志愿江南大学环境工程085701 +3 Djdjj12 2026-03-10 4/200 2026-03-14 00:31 by JourneyLucky
[考研] 308求调剂 +3 是Lupa啊 2026-03-10 3/150 2026-03-14 00:30 by JourneyLucky
[考研] 0805，333求调剂 +3 112253525 2026-03-10 3/150 2026-03-13 23:42 by JourneyLucky
[考研] 材料371求调剂 +9 鳄鱼? 2026-03-11 11/550 2026-03-13 22:53 by JourneyLucky
[考研] 304求调剂 +7 7712b 2026-03-13 7/350 2026-03-13 21:42 by peike
[考研] 求调剂 资源与环境 285 +3 未名考生 2026-03-10 3/150 2026-03-13 10:31 by houyaoxu
[考研] 283求调剂，材料、化工皆可 +8 苏打水7777 2026-03-11 10/500 2026-03-13 09:06 by Linda Hu
[考研] 321求调剂（食品/专硕） +3 xc321 2026-03-12 6/300 2026-03-13 08:45 by xc321
[考研] 085600 材料与化工 295 求调剂 +10 dream…… 2026-03-10 12/600 2026-03-12 13:46 by dream……
[考研] 调剂 +5 呵唔哦豁 2026-03-10 5/250 2026-03-10 22:00 by 28375m
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭