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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 网络生活区 » 有奖问答 » 实验讨论 » 除了利用同源性做PCR外，如何定向筛选一个基因？
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隔夜凉白开

新虫 (小有名气)

[求助] 除了利用同源性做PCR外，如何定向筛选一个基因？

我目前在做一个菌株中纤维素酶的扩增分析，原定方案是简单的利用其他已知纤维素酶的同源性设计引物把我要的目的基因P出来，但是可能因为我实验的菌株同源性差，一直是阴性实验结果。现在想向各位高手请教下，还有什么别的较为简便的方法能筛选扩增出一个基因？时间比较紧迫。我还设想过用基因陷阱，但是这能定向筛出目的基因吗？
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1楼 2012-01-12 11:44:41
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海阔天空8158

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
xuanzhang(金币+1): 谢谢参与交流 2012-01-16 23:00:20
隔夜凉白开(金币+1): ★★★很有帮助 2012-03-07 17:33:13
实际上，就是单纯的利用同源性的方法，也不一定行不通的。
首先，使用几种进化上比较接近的几个种属目的蛋白进行blast，找到比较保守的氨基酸序列，然后合成简并引物。电泳后，切下条带测序。如果能够得到一些目的基因的核苷酸序列信息的话，那么可以继续做RACE。

祝实验顺利。
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天行健，君子以自强不息；地势坤，君子以厚德载物。
2楼2012-01-14 16:56:03
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guojianping

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
xuanzhang(金币+1): 谢谢参与交流 2012-01-16 23:00:27
为什么不试着换换PCR条件退火温度之类
赞一下(1人) 回复此楼
3楼2012-01-16 20:44:27
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隔夜凉白开

新虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by 海阔天空8158 at 2012-01-14 16:56:03:
实际上，就是单纯的利用同源性的方法，也不一定行不通的。
首先，使用几种进化上比较接近的几个种属目的蛋白进行blast，找到比较保守的氨基酸序列，然后合成简并引物。电泳后，切下条带测序。如果能够得到一些目 ...

非常感谢您的建议，我现在已经在用 icodehop strategy设计简并引物了。
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4楼2012-03-07 17:31:22
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隔夜凉白开

新虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by guojianping at 2012-01-16 20:44:27:
为什么不试着换换PCR条件退火温度之类

已经做过梯度了，但是一直是阴性。
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5楼2012-03-07 17:32:14
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