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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 酵母菌落PCR的方法
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snowrain0913

新虫 (初入文坛)

[交流] 酵母菌落PCR的方法

大家做酵母菌落PCR都是用什么方法呢？我是先将细胞在sds里97度煮十分钟，然后用水洗两次后加入PCR体系中。但是效果很差，有没有好的建议呢？
我的PCR程序是 95℃6min
95℃20s  XX℃30s  72℃XXmin    30循环
72℃5Min
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1楼2012-01-05 16:32:27
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

imyting

至尊木虫 (正式写手)
★ ★
snowrain0913(金币+1):谢谢参与
amisking(金币+1): 鼓励发帖交流！ 2012-01-05 20:42:15
不需要煮吧，我做大肠杆菌是直接把菌液作为模板就可以了，我一直这么做的。酵母虽然是真菌，但是也不会有什么大的区别吧？
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2楼2012-01-05 17:14:24
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yedwill

新虫 (小有名气)
★
snowrain0913(金币+1):谢谢参与
直接挑点菌体加到PCR管中做模板就行
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13楼2012-01-06 10:51:08
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yandz680717

木虫 (正式写手)
★
snowrain0913(金币+1):谢谢参与
建议如果做毕氏酵母菌落PCR,可以采取先沸水煮10min,然后-80冻30min,再沸水中煮10min,重复性比较好
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15楼2012-01-07 08:30:05
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普通回帖

西瓜

荣誉版主 (知名作家)
★ ★ ★ ★
snowrain0913(金币+1):谢谢参与
wanhscn(金币+3, 专家考核): ood！ 2012-01-06 12:12:59
引用回帖:
2楼: Originally posted by imyting at 2012-01-05 17:14:24:
不需要煮吧，我做大肠杆菌是直接把菌液作为模板就可以了，我一直这么做的。酵母虽然是真菌，但是也不会有什么大的区别吧？

酵母细胞壁很厚，比较难破胞。我见有的实验室是加个裂解缓冲液，然后微波炉加热来破胞的。详情得打听下了。
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3楼2012-01-05 17:25:38
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imyting

至尊木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 西瓜 at 2012-01-05 17:25:38:
酵母细胞壁很厚，比较难破胞。我见有的实验室是加个裂解缓冲液，然后微波炉加热来破胞的。详情得打听下了。

学习了
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4楼2012-01-05 17:32:57
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snowrain0913

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by 西瓜 at 2012-01-05 17:25:38:
酵母细胞壁很厚，比较难破胞。我见有的实验室是加个裂解缓冲液，然后微波炉加热来破胞的。详情得打听下了。

开始加SDS煮十分钟就是为了破壁的，但还是什么都P不出来啊，感觉不应该是转化的问题
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5楼2012-01-05 18:04:51
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liuyu_sdili

木虫 (正式写手)
★
snowrain0913(金币+1):谢谢参与
貌似分子克隆里面有啊
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6楼2012-01-05 18:33:10
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凡子1985

银虫 (小有名气)
★ ★ ★
snowrain0913(金币+1):谢谢参与
西瓜(金币+2): 鼓励应助！ 2012-01-05 23:02:06
不需要那么麻烦，直接挑菌涂在管里，然后放微波炉里最大温度转1分钟，然后加入反应体系就可以了，我们实验室都这么做，不要想的太困难。
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7楼2012-01-05 20:50:31
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lw19850128

银虫 (小有名气)
★
snowrain0913(金币+1):谢谢参与
同2楼，直接用菌液代替模板
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8楼2012-01-06 09:40:37
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小丹木木

荣誉版主 (著名写手)
★ ★ ★ ★
snowrain0913(金币+1):谢谢参与
wanhscn(金币+3): Good！辛苦了！ 2012-01-06 12:13:31
引用回帖:
2楼: Originally posted by imyting at 2012-01-05 17:14:24:
不需要煮吧，我做大肠杆菌是直接把菌液作为模板就可以了，我一直这么做的。酵母虽然是真菌，但是也不会有什么大的区别吧？

酵母细胞壁厚，是一定预先破壁的，不然不能菌落PCR
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9楼2012-01-06 10:01:42
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snowrain0913

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by 凡子1985 at 2012-01-05 20:50:31:
不需要那么麻烦，直接挑菌涂在管里，然后放微波炉里最大温度转1分钟，然后加入反应体系就可以了，我们实验室都这么做，不要想的太困难。

那效果如何呢？我在SDS里97度煮十分钟和您在微波炉里转1分钟应该差不多吧？
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10楼2012-01-06 10:04:34
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小丹木木

荣誉版主 (著名写手)
在预热的时候延长时间，在设计PCR体系是时候，这样试试
95℃  10~15min
95℃20s  XX℃30s  72℃XXmin    30循环
72℃5Min
我做的时候，就这样子的，都能P出来的。

[ Last edited by 小丹木木 on 2012-1-6 at 10:51 ]
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11楼2012-01-06 10:07:48
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mlw8486

银虫 (正式写手)
★ ★
snowrain0913(金币+1):谢谢参与
小丹木木(金币+1): 鼓励积极交流哦 2012-01-06 10:53:02
我觉得你还是做个阳性对照靠谱些   不然不知道是你破菌的问题还是你PCR的问题还是你根本就没有将质粒转进去    所以呢    还是考虑周全些比较好
赞一下(2人) 回复此楼
12楼2012-01-06 10:35:16
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snowrain0913

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by 小丹木木 at 2012-01-06 10:07:48:
在预热的时候延长时间，在设计PCR体系是时候，这样试试
95℃  10~15min
95℃20s  XX℃30s  72℃XXmin    30循环
72℃5Min
我做的时候，就这样子的，都能P出来的。
[ Last edited by 小丹木木 on 2012-1-6 ...

之前已经先97度煮10Min 后来又95度煮6分钟 这样还不够吗？
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14楼2012-01-06 18:21:29
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scofield111

银虫 (正式写手)
★
snowrain0913(金币+1): 谢谢参与
引用回帖:
12楼: Originally posted by mlw8486 at 2012-01-06 10:35:16
我觉得你还是做个阳性对照靠谱些   不然不知道是你破菌的问题还是你PCR的问题还是你根本就没有将质粒转进去    所以呢    还是考虑周全些比较好

怎么做阳性对照呢
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16楼2016-04-18 15:40:39
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