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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 菌落PCR无条带
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笔冰河

银虫 (小有名气)

[求助] 菌落PCR无条带

双酶切T载体和表达载体后，回收获得目的片段和载体，连接，转化，挑18个单克隆，菌落PCR全部无条带，这是怎么回事，目的片段确定酶切成功，表达载体无法从电泳图上确定是否两个位点都酶切成功（两个酶切位点紧连着）。可能是什么原因呢？
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1楼 2011-12-19 19:02:26
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
引用回帖:
17楼: Originally posted by xujie158 at 2011-12-27 16:48:45:
菌P其实一般都是没有问题的，提质粒PCR只适合做平时小量的一个验证，假如你有大量的连接要做，你基本上就不能选择提质粒之后再PCR，因为太浪费时间，另外对于一些新手，辛辛苦苦提半天再没有，更容易打消积极性。 ...

我也赞成。菌落PCR适合大批量筛选，可以用来做第一次的筛选。挑到几个阳性克隆后，再提质粒进行酶切验证，这样鉴定出来的阳性克隆基本不会错了。
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18楼2011-12-27 17:29:59
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xhy0016

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
笔冰河(金币+1): 2011-12-20 14:40:56
你为什么不提质粒跑电泳验证一下，而非要直接菌落PCR呢
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2楼2011-12-19 19:09:00
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笔冰河

银虫 (小有名气)
★
西瓜(金币+1): 我也觉得~ 2011-12-27 17:25:42
引用回帖:
楼: Originally posted by xhy0016 at 2011-12-19 19:09:00:
你为什么不提质粒跑电泳验证一下，而非要直接菌落PCR呢

一般不是都先菌落PCR吗，几十个菌落，提质粒成本太高了，而且还需要过夜摇菌
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3楼2011-12-20 08:35:06
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shaquila

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
笔冰河(金币+1): 去磷酸化的条件是什么呢，要自己配溶液吗，还是有试剂盒买 2011-12-20 14:40:34
西瓜(金币+3): Good 2011-12-22 18:34:35
有这么多假阳性？一般我连接载体，阳性率高于90%。只有当PCR直接酶切时候，有部份结果连接错误。所以我觉的还是酶切不完全吧。菌液PCR有做对照吗？如果是阳性一般都有条带。楼主如果不想更改酶切体系，可以试试去磷酸化。
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4楼2011-12-20 09:03:18
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