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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 凝胶层析图谱问题
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BIO-che

新虫 (小有名气)

[求助] 凝胶层析图谱问题

我是做蛋白质纯化的，第一次装柱就跑凝胶，结果有3个气泡，没有发现，跑了一次后，出了2个峰。后来重新装柱，结果发现少了一个峰，原来那个小峰的地方变成一个很小的突起。但是两次上样的量是一样的。
我两次出峰的时间都比较短，大约是走了0.5个柱子体积就出第一个峰，第二个峰大约是0.7-0.8个柱体积就出峰了。
而我的蛋白质条带大约在60KD以下的为主，用的是进口的S-200
各位大侠觉得我是哪里出问题了？
见2，3楼

[ Last edited by 1949stone on 2011-12-18 at 22:04 ]
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1楼 2011-12-16 21:18:28
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BIO-che

新虫 (小有名气)
http://good.gd/1841786.htm
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  • 附件 1 : BIO-che3张纯化图.rar
    • 2011-12-17 19:54:38, 180.62 K
3楼2011-12-17 19:55:22
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BIO-che

新虫 (小有名气)
3张图的时间顺序就是这样。第1张是有气泡的柱子跑的。第3张加样量加大了0.5倍，好像大峰的右边是不是还有一个小峰，没有分开？丢掉的小峰就是第1张中的第1个峰
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4楼2011-12-17 19:58:11
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BIO-che

新虫 (小有名气)
因为我的电压值很小，别人的大多在100以上 我的只有在1以下，所以很麻烦。我用+1至 -1 的范围内做色谱图，结果峰不是很大，但时看不到这个右边的小峰 只有到了你看到的这个范围 才能看到那个小峰。 所以此时的基线变得很不稳。 如果+10 至-1的范围 基线就很直了！！我唯一想不通的是，柱子中有气泡竞会多出了一个峰，难道有气泡的分辩率会更好？
还有一个更奇怪的，分子筛过完后，纯化倍数下降了，酶与蛋白浓度的比值竞变小了？
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7楼2011-12-18 20:45:30
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BIO-che

新虫 (小有名气)
分子筛会不会特异性吸附淀粉酶啊？
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8楼2011-12-18 20:48:13
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BIO-che

新虫 (小有名气)
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引用回帖:
楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-12-19 15:01:19:
空气是会产生紫外吸收的，会有一点气泡随着流动相出来引起A280波动。

淀粉酶是酶，上样前可能有些离子促进酶活力，除去之后自然就下降了。之前的比活力可能是假象，现在才是真相。

但是重装后 原来有小峰的地方 是一个很小的突起。同时我想问的是分子筛是不是会吸附一些离子啊？我上样的时候用的是PH5.0缓冲液+0.15摩尔每升的氯化钠 应该会避免分子筛的吸附吧
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10楼2011-12-20 00:14:25
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BIO-che

新虫 (小有名气)
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引用回帖:
楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-12-20 06:50:46:
分子筛会脱盐，使蛋白质样品里原本含有的盐与蛋白质分开，不知道会不会吸附离子。

我的分子筛的柱子只有45厘米高，会不会这个长度造成了我的分子筛效果不好。我跑电泳时，离子胶处理后的条带与分子筛处理后的结果没有差别。我的目标大约在60 而有大量的杂蛋白在10-30左右。这怎么会分不开呢？难道是我的分部收集管污染了？
我的管子是用水煮沸10分钟，用自来水洗后，再用蒸馏水洗净后烘干。管子上的塞子只是洗净没有煮沸灭菌 这样会影响吗？电泳的枪头全是灭过菌的？
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12楼2011-12-20 23:42:01
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BIO-che

新虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-12-21 00:10:16:
10和60都不能分开，那你只能换别的凝胶过滤柱了，这稍微夸张了点，多少都会有点开的。那么多层析柱为什么纠结于这个？

我们实验室的条件有限，估计只能在要S－200   G-75中下文章，我和老板谈了一下，疏水柱可能有点困难，估计目前只能采用加长柱身的方法，加入大量的S-200. 我想S-200不至于连60与10都分不开 ，这也太奇怪了 。会不会是我装柱或者哪里出问题？
我的离子胶分离的最后结果与分子筛是一样，（电 泳）也就是两者没有区别，不太可能啊？
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14楼2011-12-21 14:52:09
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BIO-che

新虫 (小有名气)
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引用回帖:
楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-12-21 17:43:25:
这张电泳图是非变性胶，第一个泳道是电泳纯的酶，后面的所有泳道都是层析后的收集液，你看看我一下子能去掉多少条带？起码有15条！

切胶是用什么办法回收？是专门的试剂盒吗？
我的导师也想过类似的方法，只是苦于找不到温和的回收方法，因为如果像DNA那样回收的话，要将胶于90度左右融化，再离心取上清液，跑PCR就可以跑出目标DNA，而酶在这种 方法下可能做不到啊？
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17楼2011-12-22 00:21:34
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BIO-che

新虫 (小有名气)
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引用回帖:
楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-12-21 17:43:25:
这张电泳图是非变性胶，第一个泳道是电泳纯的酶，后面的所有泳道都是层析后的收集液，你看看我一下子能去掉多少条带？起码有15条！

问一下你是对割出来的胶是怎么处理的？我一直处理不了 谢谢
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18楼2011-12-24 21:49:49
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