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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 凝胶层析图谱问题
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BIO-che

新虫 (小有名气)

[求助] 凝胶层析图谱问题

我是做蛋白质纯化的，第一次装柱就跑凝胶，结果有3个气泡，没有发现，跑了一次后，出了2个峰。后来重新装柱，结果发现少了一个峰，原来那个小峰的地方变成一个很小的突起。但是两次上样的量是一样的。
我两次出峰的时间都比较短，大约是走了0.5个柱子体积就出第一个峰，第二个峰大约是0.7-0.8个柱体积就出峰了。
而我的蛋白质条带大约在60KD以下的为主，用的是进口的S-200
各位大侠觉得我是哪里出问题了？
见2，3楼

[ Last edited by 1949stone on 2011-12-18 at 22:04 ]
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1楼 2011-12-16 21:18:28
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
wanhscn(金币+5, MolEPI+1): 精彩完整应助！理应授予EPI！ 2011-12-21 10:10:38
10和60都不能分开，那你只能换别的凝胶过滤柱了，这稍微夸张了点，多少都会有点开的。那么多层析柱为什么纠结于这个？
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
13楼2011-12-21 00:10:16
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, MolEPI+1): Good!有图有真相，呵呵~辛苦！ 2011-12-21 17:50:35
引用回帖:
15楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-12-21 17:22:01:
那你增加一步，跑活性胶，切胶，纯度会有提高的。

这张电泳图是非变性胶，第一个泳道是电泳纯的酶，后面的所有泳道都是层析后的收集液，你看看我一下子能去掉多少条带？起码有15条！
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BIO-che BIO-che
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16楼2011-12-21 17:43:25
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普通回帖

冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
上图
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2楼2011-12-17 01:31:33
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BIO-che

新虫 (小有名气)
http://good.gd/1841786.htm
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3楼2011-12-17 19:55:22
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BIO-che

新虫 (小有名气)
3张图的时间顺序就是这样。第1张是有气泡的柱子跑的。第3张加样量加大了0.5倍，好像大峰的右边是不是还有一个小峰，没有分开？丢掉的小峰就是第1张中的第1个峰
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4楼2011-12-17 19:58:11
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
★ ★
西瓜(金币+2): Good! 2011-12-18 18:18:31
我已经看过图了，60KD的蛋白质属于S200的分离范围，肯定会在一个柱床体积内出来的。既然蛋白质是多个，那么无论是一个还是2个峰都是没用的，都得不到纯的单条带组分的，换别的分离方法吧。
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5楼2011-12-18 14:32:22
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
★
西瓜(金币+1): 高人！ 2011-12-18 18:18:42
而且这条A280基线跳动得太剧烈了，机器有问题，可能是光源。
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6楼2011-12-18 14:33:49
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BIO-che

新虫 (小有名气)
因为我的电压值很小，别人的大多在100以上 我的只有在1以下，所以很麻烦。我用+1至 -1 的范围内做色谱图，结果峰不是很大，但时看不到这个右边的小峰 只有到了你看到的这个范围 才能看到那个小峰。 所以此时的基线变得很不稳。 如果+10 至-1的范围 基线就很直了！！我唯一想不通的是，柱子中有气泡竞会多出了一个峰，难道有气泡的分辩率会更好？
还有一个更奇怪的，分子筛过完后，纯化倍数下降了，酶与蛋白浓度的比值竞变小了？
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7楼2011-12-18 20:45:30
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BIO-che

新虫 (小有名气)
分子筛会不会特异性吸附淀粉酶啊？
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8楼2011-12-18 20:48:13
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
空气是会产生紫外吸收的，会有一点气泡随着流动相出来引起A280波动。

淀粉酶是酶，上样前可能有些离子促进酶活力，除去之后自然就下降了。之前的比活力可能是假象，现在才是真相。
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9楼2011-12-19 15:01:19
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BIO-che

新虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-12-19 15:01:19:
空气是会产生紫外吸收的，会有一点气泡随着流动相出来引起A280波动。

淀粉酶是酶，上样前可能有些离子促进酶活力，除去之后自然就下降了。之前的比活力可能是假象，现在才是真相。

但是重装后 原来有小峰的地方 是一个很小的突起。同时我想问的是分子筛是不是会吸附一些离子啊？我上样的时候用的是PH5.0缓冲液+0.15摩尔每升的氯化钠 应该会避免分子筛的吸附吧
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10楼2011-12-20 00:14:25
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