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zplipeng

金虫 (著名写手)

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[交流] WB检测磷酸化蛋白的详细步骤及注意事项

1、各位提取的细胞是贴壁的吗？是先消化再加裂解液还是直接向培养皿中加裂解液？我尝试了一下在培养皿（10cm）中加裂解液（300ul），因为不能加的少（盖不过来），最后提取的蛋白只有3mg/ml。而我先收集细胞后再加的裂解液，细胞浓度可以达到40mg/ml。但我担心收集细胞以及洗涤，冰冻裂解（液氮冰冻三次，因为没有超声波仪器）的过程会导致降解。可以说明您具体的提取方法吗？最好有详细的步骤
2、做蛋白磷酸化的PAGE时，各位上样多少ul？每孔多少蛋白？我一开始做的时候一般每孔上样20uL（10uL蛋白+10uL Loadingbuffer），因为提取的蛋白浓度几乎为30-40ug/ul，所以跑出来的蛋白条带往往连在一起。导致内参检测成一条线。
3、各位提取的蛋白现用嘛？还是在-80度保存？
4、各位转膜的条件是什么？
谢谢啦。

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