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涛声依旧本人

银虫 (初入文坛)

[交流] western样品处理问题 已有4人参与

western样品处理，各位大虾们有木有什么好办法哦？
跪求各方意见哦，呵呵、、、、
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1楼 2011-11-19 11:13:44
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zhaoyonggang

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
这个你得问得具体点，什么样品啊？
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2楼2011-11-19 11:31:47
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noah1020

新虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
西瓜(金币+5, MolEPI+1): Good！很活跃哦，继续加油哈~ 2011-11-23 20:26:22
细胞样品还是组织样品？我的方法很普遍，但是要求操作条件比较严格~
这样，收集细胞（或者把组织剪成碎片），离心后弃掉上清培养基，然后加入组织/细胞裂解液，一般都用RIPA或者cell lysis，但是一定记住要加足够量的蛋白酶抑制剂！！！有用PMSF的，但是我觉得Roche公司的“Protease Inhibitor Cocktail Tables”更好用~ 在冰上静置20-30min等细胞、组织裂解稍完全些，上超声振荡或者组织研磨仪，把细胞、组织打成粉碎均一的匀浆液；再高转速离心（14000rpm），3-5min，你会发现没有裂开的组织纤维或者细胞碎片都粘在管底了，上清就都是你的蛋白！
LZ注意啊，操作整个过程尽量都要在冰上进行！！！
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3楼2011-11-23 15:48:38
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涛声依旧本人

银虫 (初入文坛)
提蛋白这个我知道，我提蛋白是用密度梯度离心的
我也想知道上样之前，就是蛋白提出来之后的保存及上样前是先变性再和上样缓冲液混合，还是先和上样缓冲液混合再变性，
谢谢
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4楼2011-11-24 16:56:00
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2011加油

银虫 (正式写手)
★ ★
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wanhscn(金币+1): 鼓励交流 2011-11-25 21:34:03
蛋白保存于负80度。

计算好蛋白上样量后，取各组蛋白样品置于EP管，各组用TBST溶液补齐体积，将5×loading buffer加入后，进行95度热变性5分钟，再离心一下，就可以上样了。
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每天都是新开始，2011，要好好努力！
5楼2011-11-25 20:15:35
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xuwei119

新虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
没有上样缓冲液怎么变性？难到你单加SDS
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6楼2011-11-30 15:51:25
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