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happyxiaoli

铜虫 (小有名气)

[求助] 大鼠气管上皮细胞培养方法 已有1人参与

我最近做大鼠气管上皮细胞原代培养，用酶消化法，用了好几种没消化，得到的细胞数都特别少。
   我的方法是：取大鼠2只，麻醉后，在无菌条件下取气管，用冷的PBS液冲洗，分离除去其他粘膜组织，再用PBS（含青-链双抗）液冲洗3遍，结扎一端，灌入0.25%胰酶，结扎另一端，4度，冰箱过夜。剪开结扎线，加入10%的小牛血清的DMEM培养液终止消化。将液体转移置于10ml离心管中，1000r/min,10min.培养液冲洗重复一次，加培养液吹达成细胞悬液，计数，发现，细胞的数量特别少。做了好几次都是一样的结果，我还试了0.25%中性蛋白酶，结果差不多。
    现在找不出原因，请师哥师姐，朋友们帮帮忙，帮我分析一下，非常感谢！！！急！急！急！
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读书需用意，一字值千金！
1楼 2011-11-09 11:09:07
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guifang

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
wanhscn(金币+3): Good!鼓励分享! 2011-11-10 21:26:33
我个人感觉是温度的问题，胰蛋白酶在4℃的活性，几乎可以忽略不计了。我原来做原代细胞的时候，是将组织剪碎，然后加入胰蛋白酶，放入37℃培养箱中培养30min，然后加培养基终止消化，放入培养箱中培养，最好前面几天不要去移动细胞。
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2楼2011-11-10 08:43:47
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happyxiaoli

铜虫 (小有名气)
★
wanhscn(金币+1): 可以在某回帖者的右下点 引用回复 这样该回帖者才会收到! 2011-11-11 21:48:16
谢谢上面的朋友，您做的也是气管上皮细胞吗?您说的温度问题，我也试过把气管剪碎了，加酶，37度消化，最后消化的组织成丝状物了，黏黏的聚在一起，感觉消化不动了，把消化液离心1000r/min,10min，观察，结果还是没有多少细胞，不知道细胞都哪去了。
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读书需用意，一字值千金！
3楼2011-11-10 13:45:24
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happyxiaoli

铜虫 (小有名气)
再就是我看的文献还有参考书做气管的多数是往气管里灌酶（分离细胞培养法），按理说低温消化，酶活性低，但时间也是长呀，这样可以降低上皮细胞的受损程度，结果还是不理想.我现在是特别着急，请各位做过的，或是有相关经验朋友帮帮忙，多多指教，在这先谢谢各位了！！！
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4楼2011-11-10 13:50:13
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happyxiaoli

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by guifang at 2011-11-10 08:43:47:
我个人感觉是温度的问题，胰蛋白酶在4℃的活性，几乎可以忽略不计了。我原来做原代细胞的时候，是将组织剪碎，然后加入胰蛋白酶，放入37℃培养箱中培养30min，然后加培养基终止消化，放入培养箱中培养，最好前面几 ...

谢谢上面的朋友，您做的也是气管上皮细胞吗?您说的温度问题，我也试过把气管剪碎了，加酶，37度消化，最后消化的组织成丝状物了，黏黏的聚在一起，感觉消化不动了，把消化液离心1000r/min,10min，观察，结果还是没有多少细胞，不知道细胞都哪去了。
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5楼2011-11-11 23:24:38
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guifang

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
wanhscn(金币+5): good!对楼主有帮助!破格授予一个专家指数,再接再厉! 2011-11-12 10:09:12
wanhscn(MolEPI+1): 2011-11-12 10:09:33
引用回帖:
楼: Originally posted by happyxiaoli at 2011-11-11 23:24:38:
谢谢上面的朋友，您做的也是气管上皮细胞吗?您说的温度问题，我也试过把气管剪碎了，加酶，37度消化，最后消化的组织成丝状物了，黏黏的聚在一起，感觉消化不动了，把消化液离心1000r/min,10min，观察，结果还是 ...

我做的是关节滑膜细胞，我看你写的方法，好像在消化的整个过程中没有进行吹打，每10分钟左右对其吹打一次，效果应该会好点。消化完成后，我先先在显微镜下观察，会有较多细胞，但离心后，也出现减少，所以我不建议离心，直接将所有东西转移至培养瓶培养。4度情况下，胰酶几乎没有活力，过夜来说，也没多少细胞，文献上的很多都是“牛人”，他们的实验要重复出来很难，仅供参考

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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6楼2011-11-12 03:59:34
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happyxiaoli

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by guifang at 2011-11-12 03:59:34:
我做的是关节滑膜细胞，我看你写的方法，好像在消化的整个过程中没有进行吹打，每10分钟左右对其吹打一次，效果应该会好点。消化完成后，我先先在显微镜下观察，会有较多细胞，但离心后，也出现减少，所以我不建 ...

非常感谢！您帮我分析的问题，我再按您说的试试，
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7楼2011-11-13 21:59:42
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happyxiaoli

铜虫 (小有名气)
哪位高手，救救我吧------
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8楼2011-11-21 10:18:38
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jialiyang

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

用进口的pronase 消化 我们实验室做过小鼠气管上皮细胞的消化 效果不错
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9楼2012-08-29 21:44:20
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xiayu123

禁虫 (初入文坛)
本帖内容被屏蔽
10楼2014-07-22 12:19:08
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