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happyxiaoli

铜虫 (小有名气)

[求助] 大鼠气管上皮细胞培养方法 已有1人参与

我最近做大鼠气管上皮细胞原代培养，用酶消化法，用了好几种没消化，得到的细胞数都特别少。
   我的方法是：取大鼠2只，麻醉后，在无菌条件下取气管，用冷的PBS液冲洗，分离除去其他粘膜组织，再用PBS（含青-链双抗）液冲洗3遍，结扎一端，灌入0.25%胰酶，结扎另一端，4度，冰箱过夜。剪开结扎线，加入10%的小牛血清的DMEM培养液终止消化。将液体转移置于10ml离心管中，1000r/min,10min.培养液冲洗重复一次，加培养液吹达成细胞悬液，计数，发现，细胞的数量特别少。做了好几次都是一样的结果，我还试了0.25%中性蛋白酶，结果差不多。
    现在找不出原因，请师哥师姐，朋友们帮帮忙，帮我分析一下，非常感谢！！！急！急！急！
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读书需用意，一字值千金！
1楼 2011-11-09 11:09:07
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xiayu123

禁虫 (初入文坛)
本帖内容被屏蔽
10楼2014-07-22 12:19:08
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guifang

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
wanhscn(金币+3): Good!鼓励分享! 2011-11-10 21:26:33
我个人感觉是温度的问题，胰蛋白酶在4℃的活性，几乎可以忽略不计了。我原来做原代细胞的时候，是将组织剪碎，然后加入胰蛋白酶，放入37℃培养箱中培养30min，然后加培养基终止消化，放入培养箱中培养，最好前面几天不要去移动细胞。
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2楼2011-11-10 08:43:47
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happyxiaoli

铜虫 (小有名气)
★
wanhscn(金币+1): 可以在某回帖者的右下点 引用回复 这样该回帖者才会收到! 2011-11-11 21:48:16
谢谢上面的朋友，您做的也是气管上皮细胞吗?您说的温度问题，我也试过把气管剪碎了，加酶，37度消化，最后消化的组织成丝状物了，黏黏的聚在一起，感觉消化不动了，把消化液离心1000r/min,10min，观察，结果还是没有多少细胞，不知道细胞都哪去了。
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读书需用意，一字值千金！
3楼2011-11-10 13:45:24
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happyxiaoli

铜虫 (小有名气)
再就是我看的文献还有参考书做气管的多数是往气管里灌酶（分离细胞培养法），按理说低温消化，酶活性低，但时间也是长呀，这样可以降低上皮细胞的受损程度，结果还是不理想.我现在是特别着急，请各位做过的，或是有相关经验朋友帮帮忙，多多指教，在这先谢谢各位了！！！
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读书需用意，一字值千金！
4楼2011-11-10 13:50:13
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