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happyxiaoli

铜虫 (小有名气)

[求助] 大鼠气管上皮细胞培养方法 已有1人参与

我最近做大鼠气管上皮细胞原代培养,用酶消化法,用了好几种没消化,得到的细胞数都特别少。
   我的方法是:取大鼠2只,麻醉后,在无菌条件下取气管,用冷的PBS液冲洗,分离除去其他粘膜组织,再用PBS(含青-链双抗)液冲洗3遍,结扎一端,灌入0.25%胰酶,结扎另一端,4度,冰箱过夜。剪开结扎线,加入10%的小牛血清的DMEM培养液终止消化。将液体转移置于10ml离心管中,1000r/min,10min.培养液冲洗重复一次,加培养液吹达成细胞悬液,计数,发现,细胞的数量特别少。做了好几次都是一样的结果,我还试了0.25%中性蛋白酶,结果差不多。
    现在找不出原因,请师哥师姐,朋友们帮帮忙,帮我分析一下,非常感谢!!!急!急!急!
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happyxiaoli

铜虫 (小有名气)

哪位高手,救救我吧------
读书需用意,一字值千金!
8楼2011-11-21 10:18:38
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guifang

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
wanhscn(金币+3): Good!鼓励分享! 2011-11-10 21:26:33
我个人感觉是温度的问题,胰蛋白酶在4℃的活性,几乎可以忽略不计了。我原来做原代细胞的时候,是将组织剪碎,然后加入胰蛋白酶,放入37℃培养箱中培养30min,然后加培养基终止消化,放入培养箱中培养,最好前面几天不要去移动细胞。
2楼2011-11-10 08:43:47
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happyxiaoli

铜虫 (小有名气)


wanhscn(金币+1): 可以在某回帖者的右下点 引用回复 这样该回帖者才会收到! 2011-11-11 21:48:16
谢谢上面的朋友,您做的也是气管上皮细胞吗?您说的温度问题,我也试过把气管剪碎了,加酶,37度消化,最后消化的组织成丝状物了,黏黏的聚在一起,感觉消化不动了,把消化液离心1000r/min,10min,观察,结果还是没有多少细胞,不知道细胞都哪去了。
读书需用意,一字值千金!
3楼2011-11-10 13:45:24
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happyxiaoli

铜虫 (小有名气)

再就是我看的文献还有参考书做气管的多数是往气管里灌酶(分离细胞培养法),按理说低温消化,酶活性低,但时间也是长呀,这样可以降低上皮细胞的受损程度,结果还是不理想.我现在是特别着急,请各位做过的,或是有相关经验朋友帮帮忙,多多指教,在这先谢谢各位了!!!
读书需用意,一字值千金!
4楼2011-11-10 13:50:13
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