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[求助]
试剂盒能否在我的实验中使用
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各位前辈，我的实验第一步是提取DNA，后面要做SSR及同源克隆等，但是由于我提取的是真菌的孢子，存在的问题是孢子量很少，而且孢子破壁很困难。为了解决孢子量少的问题，前一段时间我用了液氮研磨法、液氮加石英砂研磨法、直接CTAB研磨法等使孢子尽量破壁，但是效果都不理想，提到的DNA要么检测不出来，要么被机械破坏，机械破坏是研磨过程中造成的，可是不尽力研磨的话孢子破不了啊,本来孢子就没多少。当然有同学跟我说，没检测出来的DNA可以直接做PCR的，而且有条带，可是我不想冒着这样的风险，最好还是检测出来比较好。于是实在没有办法的情况下，我想试一下试剂盒，可是师姐说试剂盒提的少而且效果不一定好，那么针对我这种材料少到1—5mg的且难破壁的东西来说，试剂盒能提出来吗？或者说提出来会不会出现没有条带之类的情况出现啊！ 番外：主要是破壁困难，孢子的量倒是能够加大一些到10mg左右~ 求助，小女子在这里跪谢了~ |
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【答案】应助回帖
doudouxiong(金币+5): 2011-11-03 22:59:12
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主要问题： 1.破壁难（众所周知孢子破壁难...） 2.样品量少 针对以上难点，有如下建议： 1.1寻找最优化的破碎方法你破碎方法的尝试很好。至于提到的DNA检测结果具体怎样？有电泳图及OD？注：个人经验认为，在液氮研磨（不管你是否加石英砂进去）过程是不存在你所说的机械破坏DNA问题的。如果你所提的DNA有降解情况，应该从整个提到过程找原因，如操作剧烈，枪头没有钝化处理等等。液氮加石英砂是个不错的组合 1.2优化裂解体系 不同的样品适用不同的裂解液。主要有以CTAB及SDS为主的两大裂解体系，建议可以尝试一下。另外延长孵育时间（65度）有时也有作用。 1.3可以咨询或联系试剂盒公司的技术支持寻求相关事宜的帮助，现在很多技术支持都很nice的。。。不过的确有像你师姐所说的情况，产量低。但也不排除有些公司的有比较优秀的针对孢子的纯化试剂盒。 2.1样品量少这个问题俺就恕莫能助了....千方百计增加多点孢子……^-^ 而且即使10mg孢子所含的DNA也不一定见得有很多。以下只供参考： 一般情况植物新鲜叶片100mgDNA产量5-30ug。（10mg孢子-0.5ug DNA?100ng DNA?又如何能很清楚的被你检测到呢？） 最后，如果实在没办法， 检测不到直接扩PCR也不失为一个好方法。 |
2楼2011-11-03 11:05:36