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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » PCR扩增去除终止密码子
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todouhy

铜虫 (小有名气)

[求助] PCR扩增去除终止密码子

最近要构建一个重组质粒，在原有的重组质粒目的基因的C末端上面加上一段基因，所以首先要去除原来目的基因的终止子TAG，设计引物后直接拿重组质粒作为模板，扩增去除终止子的目的基因，但是怎么也扩增不到我的目的条带1.7kb，我的重组质粒有5.9kb左右，载体是pse380，非特异性条带为1.5kb以及2.7kb左右，后来酶切重组质粒，胶回收1.7kb得到目的基因，用这个作为模板来扩增，跑胶还是没有，在1.0kb左右很亮的条带，用的是50-60的温度梯度，大家帮帮忙，谢谢啊，如果还有疑问，我在写清楚点！
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1楼 2011-10-30 00:07:00
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mascotte

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

原始质粒测序以后再拿来做模板。先确定你的目的基因在质粒上有。
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5楼2011-10-31 11:13:28
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章信来

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

怎么会有非特异性扩增？要知道无论是用质粒还是特异性目的片段做模板PCR扩增，体系中也只有目的片段才可能作为模版啊！我怀疑非特异性片段的出现最可能的原因就是你的扩增引物有问题的：引物是不是和目的片段内部以及载体有非特异性结合区啊！解决办法一是检查下你的突变引物，二是提高退火温度看看！
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2楼2011-10-30 20:53:20
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gongeleven

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引物特异性不太好吧，把反向引物尽可能加长些试试
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3楼2011-10-31 00:05:04
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huguangdong

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

同意楼上，引物问题，如果说从质粒上都扩增不下来目的片段，那这个引物是绝对有问题的。重新设计吧。
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4楼2011-10-31 10:29:48
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