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蜗牛061610

木虫 (小有名气)

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[求助] 将质粒上紧挨着的两个酶切位点进行双酶切后连接外源基因片段，是不是不好连接？

有人说如果质粒上两个切点紧挨着的话，双酶切容易切错。我就先用一个酶进行酶切，切完后过pcr纯化试剂盒后用第二个酶进行酶切，再过pcr纯化试剂盒进行酶连。酶连了两批，挑去转化子抽取质粒进行pcr鉴定都是假阳性，搞不清楚是什么原因。

[ 来自科研家族化学生物学 ]

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1楼 2011-10-09 14:13:32

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冰封之real

银虫 (初入文坛)

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我以前试过，在没有保护碱基的情况下酶切几乎成功不了，所以如果两个酶切位点紧挨着的话，相当于切开一头另一头就没了保护碱基，恐怕不好切

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13楼2014-01-26 09:10:55

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amilie030312

金虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

★ ★
amisking(金币+2): 鼓励应助发帖！ 2011-10-09 20:19:42
蜗牛061610(金币+2): 谢谢交流 2011-10-10 08:29:41

两个酶切位点挨的近那是有多近啊？质粒要计算保护碱基的话要计算保护碱基对不是保护碱基个数，如果保护碱基不够酶切就没办法切好，我有疑问的是你为啥每次酶切完了都要回收一下，质粒损失多大啊。另外，连接如果连接不上看是否是酶切的末端有平也有粘，这样不太好连的，最好两边都是4碱基突出的粘端是最好连的。至于假阳性，出现这个结果的可能性还真不是一句两句说得清的，一个问题一个问题排除吧。

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2楼2011-10-09 14:30:25

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