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wangdandelia

木虫 (正式写手)

[求助] 切胶回收 已有5人参与

请问各位前辈,切胶纯化的时候,用promega柱子回收需要哪些注意事项呢?
我们回收PCR产物,都是按照说明书操作的,可是回收率特别低,120ug的PCR产物回收后才得到2.5ug。谢谢咯!
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asznpb

木虫 (正式写手)

★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
adslye(金币+4): 鼓励交流,祝顺利! 2011-10-10 09:20:52
1,binding 和胶完全混合后挂柱子时候多重复两次,而且转速不宜太快,5000rpm足够了,再高就不大好了
2、75%乙醇洗涤完了注意要开盖空转,蒸发乙醇
3、洗脱的时候加双蒸水或elution buffer后在37℃放几分钟之后再离心洗脱
最后一步洗脱的时候多重复两次洗脱,每次用洗脱下的双蒸水或者elution buffer再重新加到柱子里重复洗脱
显微镜下的世界很精彩!
2楼2011-10-09 11:23:36
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
adslye(金币+4): 鼓励交流,祝顺利! 2011-10-10 09:22:34
根据你回收片段的大小<4kb,溶胶后适量加入些异丙醇大约与回收胶质量1:1。混匀后,上柱时让溶液冷却后与柱子结合两分钟再离心,75%乙醇洗涤完后可以打开盖在室内让酒精蒸发几分钟再加洗脱液,最好洗脱液在65℃温预一下,洗脱两次洗脱液体积不要太多。不知道能否解决你的问题。
hehe
3楼2011-10-09 11:33:38
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asznpb

木虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
对了,忘了说了,楼上补充的很完整,如果太大或者太小的话需要再加入异丙醇,洗脱液最好65℃预热……洗脱液加到柱子里后再37℃放置几分钟
显微镜下的世界很精彩!
4楼2011-10-09 12:19:07
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puluo-880312

木虫 (正式写手)

学习一下
5楼2011-10-09 13:32:06
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huangdi07

铁杆木虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
洗脱液洗脱的不完全,在加洗脱液后,37度多放置一段时间,效果会好很多
6楼2011-10-09 15:37:52
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wangdandelia

木虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by asznpb at 2011-10-09 11:23:36:
1,binding 和胶完全混合后挂柱子时候多重复两次,而且转速不宜太快,5000rpm足够了,再高就不大好了
2、75%乙醇洗涤完了注意要开盖空转,蒸发乙醇
3、洗脱的时候加双蒸水或elution buffer后在37℃放几分钟之后再 ...

请问是用的promega回收的吗?我以前试过放在37度里面,好像没什么改善。
7楼2011-10-09 15:56:44
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wangdandelia

木虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by lvbobo823 at 2011-10-09 11:33:38:
根据你回收片段的大小<4kb,溶胶后适量加入些异丙醇大约与回收胶质量1:1。混匀后,上柱时让溶液冷却后与柱子结合两分钟再离心,75%乙醇洗涤完后可以打开盖在室内让酒精蒸发几分钟再加洗脱液,最好洗脱液在65℃ ...

谢谢~请问你是用promega回收试剂盒做的吗?是加入对应量的binding buffer,然后再加入等量的异丙醇吗?
8楼2011-10-09 15:58:39
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wangdandelia

木虫 (正式写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by asznpb at 2011-10-09 12:19:07:
对了,忘了说了,楼上补充的很完整,如果太大或者太小的话需要再加入异丙醇,洗脱液最好65℃预热……洗脱液加到柱子里后再37℃放置几分钟

灰常感谢!!
9楼2011-10-09 15:59:15
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wangdandelia

木虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by lvbobo823 at 2011-10-09 11:33:38:
根据你回收片段的大小<4kb,溶胶后适量加入些异丙醇大约与回收胶质量1:1。混匀后,上柱时让溶液冷却后与柱子结合两分钟再离心,75%乙醇洗涤完后可以打开盖在室内让酒精蒸发几分钟再加洗脱液,最好洗脱液在65℃ ...

灰常感谢!能说一下这样做的原理吗?
10楼2011-10-09 16:00:06
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