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wangdandelia

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[求助] 切胶回收已有5人参与

请问各位前辈，切胶纯化的时候，用promega柱子回收需要哪些注意事项呢？
我们回收PCR产物，都是按照说明书操作的，可是回收率特别低，120ug的PCR产物回收后才得到2.5ug。谢谢咯！

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1楼2011-10-09 10:13:21

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asznpb

木虫 (正式写手)

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1,binding 和胶完全混合后挂柱子时候多重复两次，而且转速不宜太快，5000rpm足够了，再高就不大好了
2、75%乙醇洗涤完了注意要开盖空转，蒸发乙醇
3、洗脱的时候加双蒸水或elution buffer后在37℃放几分钟之后再离心洗脱
最后一步洗脱的时候多重复两次洗脱，每次用洗脱下的双蒸水或者elution buffer再重新加到柱子里重复洗脱

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显微镜下的世界很精彩！

2楼2011-10-09 11:23:36

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lvbobo823

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adslye(金币+4): 鼓励交流，祝顺利！ 2011-10-10 09:22:34

根据你回收片段的大小<4kb，溶胶后适量加入些异丙醇大约与回收胶质量1:1。混匀后，上柱时让溶液冷却后与柱子结合两分钟再离心，75%乙醇洗涤完后可以打开盖在室内让酒精蒸发几分钟再加洗脱液，最好洗脱液在65℃温预一下，洗脱两次洗脱液体积不要太多。不知道能否解决你的问题。

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hehe

3楼2011-10-09 11:33:38

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asznpb

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对了，忘了说了，楼上补充的很完整，如果太大或者太小的话需要再加入异丙醇，洗脱液最好65℃预热……洗脱液加到柱子里后再37℃放置几分钟

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4楼2011-10-09 12:19:07

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puluo-880312

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5楼2011-10-09 13:32:06

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huangdi07

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洗脱液洗脱的不完全，在加洗脱液后，37度多放置一段时间，效果会好很多

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6楼2011-10-09 15:37:52

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wangdandelia

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引用回帖:

2楼: Originally posted by asznpb at 2011-10-09 11:23:36:
1,binding 和胶完全混合后挂柱子时候多重复两次，而且转速不宜太快，5000rpm足够了，再高就不大好了
2、75%乙醇洗涤完了注意要开盖空转，蒸发乙醇
3、洗脱的时候加双蒸水或elution buffer后在37℃放几分钟之后再 ...

请问是用的promega回收的吗？我以前试过放在37度里面，好像没什么改善。

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7楼2011-10-09 15:56:44

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wangdandelia

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3楼: Originally posted by lvbobo823 at 2011-10-09 11:33:38:
根据你回收片段的大小<4kb，溶胶后适量加入些异丙醇大约与回收胶质量1:1。混匀后，上柱时让溶液冷却后与柱子结合两分钟再离心，75%乙醇洗涤完后可以打开盖在室内让酒精蒸发几分钟再加洗脱液，最好洗脱液在65℃ ...

谢谢~请问你是用promega回收试剂盒做的吗？是加入对应量的binding buffer,然后再加入等量的异丙醇吗？

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8楼2011-10-09 15:58:39

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