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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 大家可以看懂这样的蛋白提取方法吗？（用于双向）
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hrjxx

新虫 (小有名气)

[求助] 大家可以看懂这样的蛋白提取方法吗？（用于双向）

1.Cut the tissue in several small pieces, add 10 ml ice chilled lysis buffer (150 mM phosphate buffer pH 7.5, 0.5 % Triton x-100, 1 mM PMSF, 15 ug/ml Aprotinin, 10 ug/ml Leupeptin, 10 ug/ml Pepstatin) and homogenize (best with an electrical tissue homogenizer 3x1min, prevent from warming up through ice-water
bath) until cells are broken.
2.Transfer homogenate into 1.5 ml micro centrifuge tubes and spin for 15 min at 4 deg. Pool supernatant (~ 9 ml) determine protein concentration using a detergent compatible assay.
上面是我看到的双向的提取方法，一直看的不是很明白，不知道哪位高手可以给讲解下？我的疑点主要有两个，1.这是小颗粒的样品，没有研碎成粉末，这样能够裂解吗？2.蛋白可以很好的溶于磷酸盐缓冲液吗？？后面还要直接测定上清呢
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1楼 2011-10-03 12:58:21
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红多多

木虫 (正式写手)

版筑饭牛的日子

【答案】应助回帖

★ ★
hrjxx(金币+1): 谢谢啊，这个双向的裂解液，用尿素却区别在哪呢？ 2011-10-05 20:14:57
wanhscn(金币+2): 鼓励应助！ 2011-10-07 21:37:40
hrjxx(金币+1): 这和这个裂解液的区别在哪呢（9M尿素，4%CHAPS) 2011-10-12 20:13:28
这个显然是针对新鲜组织提取蛋白的方法呀 如果你是小颗粒样品可以先用液氮研磨，然后加裂解液，再按照后面步骤匀浆。磷酸盐缓冲液缓冲能力很强的，一般可溶性蛋白都没问题，实在不行你就要查查文献，看看别人怎么玩的，这个具体原因要具体分析了……
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可以用QQ找我……
2楼2011-10-04 12:51:55
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这个可以吗

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
hrjxx(金币+1): 谢谢啊，双向的裂解液里加尿素来溶解蛋白，和这个是一样道理吗？？ 2011-10-05 20:16:02
wanhscn(金币+2): 鼓励应助！ 2011-10-07 21:37:35
磷酸缓冲液没问题的应该是，主要是第一个问题，你不能照搬你列举的这个文献，显然材料处理方式不能一样，提取液也可以根据你的材料不同而变化，此方法材料为鲜样，用了较多蛋白酶抑制剂。。。。提取这东西吗，随意搞就好，当然，也根据目的来，一般都是粉碎之类的吧先
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3楼2011-10-04 13:40:20
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清泉

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

对于颗粒材料或者新鲜组织材料，如果是进行双向实验，一般还是需要用液氮将材料磨碎后加入磷酸盐蛋白提取液进行离心提取。
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宝剑锋从磨砺出，梅花香自苦寒来！
4楼2011-10-07 20:50:49
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hrjxx

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 这个可以吗 at 2011-10-04 13:40:20:
磷酸缓冲液没问题的应该是，主要是第一个问题，你不能照搬你列举的这个文献，显然材料处理方式不能一样，提取液也可以根据你的材料不同而变化，此方法材料为鲜样，用了较多蛋白酶抑制剂。。。。提取这东西吗，随意 ...

谢谢啊,没分了，不好意思，请问下这和这个裂解液的区别在哪呢（9M尿素，4%CHAPS)，
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5楼2011-10-12 20:15:02
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hrjxx

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 清泉 at 2011-10-07 20:50:49:
对于颗粒材料或者新鲜组织材料，如果是进行双向实验，一般还是需要用液氮将材料磨碎后加入磷酸盐蛋白提取液进行离心提取。

我们的裂解液好像是：9M尿素，4%CHAPS啊，没见过用磷酸缓冲液的 啊
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6楼2011-10-12 20:17:18
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