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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 质粒转染成功后质粒小提出现了问题
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bolomeer

铜虫 (小有名气)

[交流] 质粒转染成功后质粒小提出现了问题已有4人参与

我在做实验的时候，经过质粒转染，细菌能够在选择性平板上存活，但是质粒小题后电泳，发现外源基因的条带消失了，本人用的宿主细菌叫DH5a，a是阿尔法，质粒也是该细菌自身的质粒，外源基因有两段，经过拼接后插入到质粒中，请问造成外源基因条带消失的原因有哪些？
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1楼2011-10-02 21:56:53
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chenguestc

木虫 (职业作家)
★ ★ ★
wanhscn(金币+3): 有道理！ 2011-10-03 10:55:46
提质粒时是否有对照？
先检查是否你的提取是成功的哈。
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2楼2011-10-03 07:32:05
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jialiang310

木虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
wanhscn(金币+2): 鼓励交流！ 2011-10-03 10:59:08
你的选择性平板是不是有问题，在就是提质粒时可能出现问题，我帮人做实验时没出现过这种状况
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3楼2011-10-03 08:59:18
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zhangxn2010

木虫 (著名写手)

让一切随风飞翔
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
wanhscn(金币+3): Good！ 2011-10-03 10:58:54
这个嘛，细节还需要说一下。
你的质粒是酶切后电泳？然后目的基因与质粒的分子量比是多少？
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一直向前！
4楼2011-10-03 09:26:51
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bioartist

木虫 (正式写手)

无菌草莓
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
wanhscn(金币+5, MolEPI+1): Good！热心！专业！ 2011-10-03 10:58:12
你这说的很模糊，问题很多！
    质粒电泳未必能分析出结果，你的外源片段大小有多少，如果1Kb左右的片段，连接在5Kb的载体上，电泳时可能看不出差别，质粒在环状时电泳图谱不一定准确。推荐几种分析方法：
    1. 可以酶切载体，再以没有连接外源片段载体的酶切产物作对照；
    2. 菌落PCR，直接以菌体做PCR。常见的载体上都有通用引物，如M13F、M13R、T7、Sp6等，可以和你目的片段引物配对，以菌体为模板进行PCR，这个也可以以没有外源片段的载体作对照；
    3. 菌体电泳，直接用碱裂解法的溶液I和溶液II裂解菌体后，进行电泳， 以没有外源片段的载体作对照，条带相对滞后样品就是应该是连入外源片段的。
    通过这几种方法筛选到的阳性克隆，直接以菌体送去测序公司测序分析。你所要的阳性克隆，最终还是要通过测序结果的序列分析确定。
    希望对你有帮助，祝你成功。
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5楼2011-10-03 10:54:35
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