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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » pUC19-SalI单酶切，连个2500片段，连不上？
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shuihaizi

金虫 (小有名气)

[求助] pUC19-SalI单酶切，连个2500片段，连不上？

最近在做单酶切连接，怎么也连不上，请大家帮忙！
pUC19和2500bp的目的片段通过SalI单酶切，进行连接，不知道什么原因总是连不上？
本不应该难连啊？
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1楼 2011-09-05 21:45:00
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sunny_andy

金虫 (小有名气)
引用回帖:
1124162楼: Originally posted by 瓶儿花 at 2011-09-06 16:43:23
使用的是TAKARA的Alkaline Phosphatase（CIAP）（Calf intestine），Code No.: D2250，
反应体系：
载体 20μL
10×Alkaline Phosphatase Buffer 5μL
CIAP 1μL
ddH20  23μL
37℃水浴30min后加入1μLCIAP， ...

使用的是TAKARA的Alkaline Phosphatase（CIAP）（Calf intestine），Code No.: D2250，
反应体系：
载体 20μL
10×Alkaline Phosphatase Buffer 5μL
CIAP 1μL
ddH20  23μL
37℃水浴30min后加入1μLCIAP，50℃水浴30min，最后回收纯化。可以使用TAKARA公司的DNA片段纯化试剂盒纯化，效果很好的。

请问你得回收纯化前不需要失活吗？为什么分开 一个37度，一个50度？
着急，望回！
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13楼2012-06-13 13:50:13
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wanhscn

木虫 (职业作家)

哲学@草根

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): 鼓励热心版版 2011-09-06 07:38:23
shuihaizi(金币+2): 2011-09-06 08:59:19
载体或者目的片段去磷酸化，否则载体自连的较多，不易挑到！
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真相是最大的奢侈品
2楼2011-09-05 22:09:31
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瓶儿花

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
wanhscn(金币+2): 比较准确！ 2011-09-06 09:58:28
shuihaizi(金币+2): 2011-09-06 11:52:14
载体去磷酸化，不然会自连，目的片段可以不用去磷酸化的。做的时候加对照，以不加目的片段，只加酶切并去磷酸化的载体的连接液为对照，就能知道你载体去磷酸化的效果了。
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3楼2011-09-06 09:53:27
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wanhscn

木虫 (职业作家)

哲学@草根
引用回帖:
2楼: Originally posted by wanhscn at 2011-09-05 22:09:31:
载体或者目的片段去磷酸化，否则载体自连的较多，不易挑到！

表述有误，载体必须去磷酸化！
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真相是最大的奢侈品
4楼2011-09-06 10:00:01
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