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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 柞蚕总RNA提取中，蛋白抽提不尽
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yyll1988

银虫 (正式写手)

[求助] 柞蚕总RNA提取中，蛋白抽提不尽

这一周提取了好几次柞蚕蚕蛹RNA，每次的结果都是在加入异丙醇沉淀后出现大量的白色沉淀，经过分光光度计测定发现是被蛋白污染。上火啊。加入400μl（1ml的裂解液）氯仿后，经过震荡、静置、离心，使用黄枪头吸取，确信没有吸取中间蛋白层溶液。我也使用了氯仿进行了再次抽提，即再向吸出的上清中加入400μl氯仿，然后震荡、静置、离心。但是对结果改善不大。经离心后，出现的沉淀在管底量很大。使用的是进口的色谱级氯仿，不知道哪里出了问题。请大家多多指教。
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1楼 2011-09-04 10:43:01
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

12zhangwei

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
yyll1988(金币+5): 恭喜您啊。成功了。我本来就是用的TE缓冲液做的。无论怎么说，都要谢谢你啊！ 2011-09-06 13:57:49
dhd997(金币+5, MolEPI+1): good 2011-09-07 11:17:53
你好，你说的“对结果没有多大改善”是指经过核酸蛋白检测仪检测数据没有多大变化对吗？我第一次回帖，也是抽了两次，经过检测一样，是没什么变化。
昨天，通过takala技术咨询，她给我建议用核酸蛋白仪检测时，用TE调零，用TE稀释。我配了10MM的TE,PH约7.7，结果真的很震惊。
    同一管的RNA
                   DEPC水         TE
260 /280      1.14             2.01
260/230       1.71              2.30
A260和A280 的值我没详记，但DEPC水测的话两个值都是0.1多，很接近，所以260 /280  1.14，但用TE 测后，260变为了0.3多，而A280的值依旧是0.1多，没变化，但可以看到用TE测的值很完美，不是吗？还有一点浓度也变化很多DEPC 测才200ul/ml,而TE 的事400多。  有一点说明，我的DEPC水是买的现成的，自己配的话，260/280的是偏低的，此外，需说明RNA降解的话，260/280大于2.2，这点很肯定，至于样品的量，加多是没有问题的，原先按takala说明书上30mg/1ML,加异丙醇沉淀很少看到白色沉淀，以后做，随便加，只要不是很离谱就可以了。
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8楼2011-09-06 13:14:58
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普通回帖

zouhongda

木虫 (小有名气)
★
西瓜(金币+1): 鼓励交流。同问~ 2011-09-04 18:45:53
裂解液的成分是什么？用Trizol提取效果不好吗？
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2楼2011-09-04 12:06:00
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12zhangwei

新虫 (小有名气)
dhd997: 看五楼回复 2011-09-05 07:49:47
你好，我现在也是这个问题。说来话长。想做荧光定量，所以RNA提的质量很重要，对吧。我用takala的trizol，材料是烟草，按理说烟草的很好提。但按说明书的操作怎么做都不行。提RNA是可以提出来，但质量不好，A260/A280总是上不去，一直在1.4徘徊，而且A260/A230为0.06，后来通过takala 的技术咨询，用酒精洗两次，A260/A230变为了2.1多，这个值还是很完美的，但A260/A280还是老样子。说明有酚和蛋白污染，所以今天吸了400ul的水相后又加了等体积的氯仿抽提第二次，果然在中间还是可以看到白色物质，此时在吸取上清，只能吸约200ul的上清了，，然后加了500ul的异丙醇，做到最后，吸光值如上，很悲剧不是吗，但是更悲剧的事情是，我一直担心是自己操作不好，所以去别人的实验室学习，唯一不同的是trizol的公司不一样，其它全部一样，用我的材料，人家提出来是A260/A280   1.6 多,  A260/a230  2.3多，我对自己的实验操作还是很有自信的，但是回到自己的实验室，完全一样的处理，我的数据就那样子。很郁闷不是吗？研磨绝对没有问题。
  还有热心的虫友们， 我在网上查到一家公司的介绍是trizolr提取的rna,a260/a280 为1.6-1.8之间，你们怎么看？
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3楼2011-09-04 20:03:37
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12zhangwei

新虫 (小有名气)
忘说了，别人帮我做的时候，只抽提一次，酒精也洗了一次
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4楼2011-09-04 20:18:24
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zouhongda

木虫 (小有名气)
★ ★ ★
dhd997(金币+3): 非常感谢交流，希望下次用下引用回复，可以给他一个提醒 2011-09-05 07:50:20
12zhangwei
,烟草提应该是没问题的。你用的哪个部位，嫩叶老叶？260280比值较小的话，RNA有降解，你其实可以跑电泳看RNA的完整性。用新换的TAE，大电压跑五到十分钟观察。如果是老叶的话应该是多糖多，而非蛋白。TARAKA有一个植物提取RNA的辅助试剂，专门除多糖的。我们拿来提马铃薯块茎都没问题的。
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5楼2011-09-04 20:38:29
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匿名

用户注销 (正式写手)
★ ★
dhd997(金币+2): 最近很活跃啊，鼓励哦 2011-09-05 07:50:35
yyll1988(金币+2): 样品量的问题我已经考虑过了。我已减少了上样量。谢谢。 2011-09-06 13:55:12
本帖仅楼主可见
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6楼2011-09-04 21:21:30
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winscavin

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

yyll1988(金币+2): 不知道啊，无奈中！ 2011-09-06 13:58:12
一般试剂盒按照 提取说明说应该没有问题  可能是你的试剂量少了吧
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7楼2011-09-04 21:21:37
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12zhangwei

新虫 (小有名气)
看来没帮上你什么忙
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9楼2011-09-07 00:11:16
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ghost202

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by winscavin at 2011-09-04 21:21:37:
一般试剂盒按照 提取说明说应该没有问题  可能是你的试剂量少了吧

今天我碰到你一样的问题，谢谢你的答复给了我的提示，谢谢
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10楼2011-09-07 09:25:16
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