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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 怎么P出单链DNA？
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lyqifeih

新虫 (小有名气)

[求助] 怎么P出单链DNA？

我们实验室需要单链DNA做实验，有什么好的方法得到单链DNA？非常紧急，请各位大侠帮助。
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刚进入神经生物和电生理
1楼 2011-09-01 11:00:40
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xgxofdream

银虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): good 2011-09-02 07:01:23
lyqifeih(金币+10): 能不能在详细点，详细的普通PCR+上有引物3‘ddNTP封闭+3’外切酶消化的实验方法啊。 2011-09-02 08:19:05
1,不对称PCR
或者
2,普通PCR+上游引物为3‘ddNTP封闭 + 3’ 外切酶消化
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学习雷锋，好榜样，忠于人民忠于党
6楼2011-09-01 20:42:45
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xgxofdream

银虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+6, MolEPI+1): Good!回答很详细，辛苦了哦！ 2011-09-04 18:49:23
lyqifeih(金币+20): 2011-09-05 08:17:44
引用回帖:
1楼: Originally posted by lyqifeih at 2011-09-01 11:00:40:
我们实验室需要单链DNA做实验，有什么好的方法得到单链DNA？非常紧急，请各位大侠帮助。

其实那也不是什么很好的方法，如果你单纯是为了得到ssDNA做阳性对照的话，十分建议合成。如果你是为了建立某种检测方案的话...

目前扩增产物是单链的DNA扩增方法有：NASBA，SDA，RCA等等温扩增方案。这些你可以去google上搜索。

我提到的那个方法比较复杂，也费钱：

1）首先 合成引物的时候，将其中一个引物（上游或者下游引物）的5‘end用ddNTP封闭住。（生工可以合成，另加500大洋的修饰费）

2）正常PCR程序

3）购买T7 外切酶或者lamada外切酶（www.neb-china.com上有卖，大概670多大洋）

4）用上述酶消化你的PCR产物，由于ddNTP-5’-Primer的存在，你的dsDNA产物中有一条链的5‘ end是被ddNTP封闭的，所以酶只能消化其中的一条链，所以最终你得到了单链。

注意：我建议用biotin代替ddNTP封闭引物的5’end。因为我不清楚酶是否对ddNTP敏感。
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学习雷锋，好榜样，忠于人民忠于党
9楼2011-09-04 15:36:44
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xgxofdream

银虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

lyqifeih(金币+2): NASBA，SDA，RCA 是什么方法啊？有没有全称啊，缩写好难找啊！ 2011-09-05 08:18:44
引用回帖:
6楼: Originally posted by xgxofdream at 2011-09-01 20:42:45:
1,不对称PCR
或者
2,普通PCR+上游引物为3‘ddNTP封闭 + 3’ 外切酶消化

仔细看了下第2个方案，我说错了。应该是引物5‘end用ddNTP封闭。
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10楼2011-09-04 15:39:05
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xgxofdream

银虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

lyqifeih(金币+8): 2011-09-14 11:46:00
NASBA or SDA or RCA + isothermal amplification 搜索

NASBA: nucleic acid sequence based amplification
这是一种扩增RNA的技术，产物也是RNA。需要用到3种酶
SDA: strand displacement amplification
该技术发明之初用于DNA扩增，扩增产物有ssDNA，同时也有dsDNA。产物复杂。配合反转扩增技术，它也有用于扩增RNA的报道
RCA: rolling circle amplification
该技术实质上是一种利用信号扩增的策略检测DNA或者RNA的技术。它的产物不是目标核酸片段，而是大量的探针分子。
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学习雷锋，好榜样，忠于人民忠于党
11楼2011-09-11 13:24:25
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