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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 提出来是一回事，提得好是另外一回事-----RNA
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12zhangwei

新虫 (小有名气)

[求助] 提出来是一回事，提得好是另外一回事-----RNA

心哇凉哇凉地，电泳检测RNA条带是好的，可是测完吸光值之后，才明白又得从头再来。提了五个样
        浓度(ng/ul)      A260/A280
       51.3                         1.4
           36.9                           1.28
           57.  1                         1.34
           56.8                         1.3
          25.1                         1.35
仅拿出一个样来说，其A260=0.628
                                          A280=0.466
                                     A260/230=0.44
知道这些值的意义，是蛋白污染吗，取上清已经很小心了，别人说烟草的浓度差不多应该在1000多。唉
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1楼 2011-08-10 21:58:33
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gwbk

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, MolEPI+1): 一起奖励！不过如果是做定量什么的，这些数值还是尽量满足的好。 2011-08-10 23:18:39
引用回帖:
3楼: Originally posted by w2boluo at 2011-08-10 22:53:15:
你用的比色杯是多少微升的？这个很关键。
一般而言，我们用的紫外分光光度计的读数只有在OD值0.1到1之间才比较准，低于0.1或者高于1，都要打折扣。电泳图片好才是真的好。
我用过的杯子50ul的塑料杯，比较准，1 ...

有好多童鞋不做吸光度测定的，直接反转录，其实测定了之后值不是很好，比如A260/A280小于2，下一步也未必不成功的。
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4楼2011-08-10 23:03:08
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gwbk

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+3): Good 2011-08-10 23:19:30
12zhangwei(金币+1): 2011-08-11 09:01:55
西瓜(金币+2): 代楼主发 2011-08-13 00:28:07
1，“分子克隆”第三版有下面两段话： DNA 和 RNA 纯制品的 OD260:OD280 值分别是 1.8 和 2.0，若样品中蛋白或酚的污染较严重，则 OD260:OD280 低于上述两个数值 (p1695 倒数第 5 行)。水饱和酚在 270nm 处有特征性吸收，其 OD260:OD280（此处疑似为270:280，原因参见：http://www.med66.com/html/ziliao ... ecd07108a85983f.htm） 比值为 2 (p1697 的框内倒数第 2 行)。
2，260nm、230nm、下的吸光度分别代表了核酸、盐浓度的吸光度值，OD260/OD230<2说明去盐不充分，可以再次沉淀和70%乙醇洗涤。
，A230nm处有强吸收，有酚盐离子、硫氰酸盐或者其他有机化合物污染（分子克隆：p1697）OD260/230 大大低于 2，但 OD260，OD280 几乎不变。
3，样品中A260/A280低于2，A260/A230也低于2.0，可能存在蛋白质污染、盐离子没有除干净等问题。
4，关于A260/A280判断纯度的正确性问题。
通常，使用 A260/A280 判断核酸的纯度。A260/A280 是一个给大家带来许多困惑的指标。以RNA为例，首先要明确该指标用于核酸的原始含义是：纯的 RNA，其 A260/A280 = 2.0 左右。纯 RNA 是‘因’，A260/A280 = 2 是‘果’。现在大家却在拿 A260/A280 当‘因’用，认为“如果 A260/A280 = 2，所以 RNA 是纯的”，自然会产生困惑。有兴趣的话，可以在你的 RNA 样品中加入一点抽提中经常使用的试剂，如苯酚，异硫氰酸胍，PEG 等，再测 A260/A280 比值。现实是，许多抽提 RNA 时使用的试剂，以及样品中的许多杂质都在 A260 和 A280 处附近有吸收，对 A260/A280 产生影响。
目前最具有指导性的做法是：对 RNA 样品在 200-300 nm 范围扫描。纯 RNA 的曲线具有如下特点：曲线平滑，A230 和 A260 是两个拐点，A300 接近 0，A260/A280 = 2 左右，A260/A230 = 2 左右，A260/A215 = 1 左右。如果没有扫描数据，除了测定 A260/A280 比值外，也一定要测定 A260/A230 比值，因为该比值对所有影响酶反应的杂质的残留更敏感。另外，要考虑设备的线形范围 (如 A260 要处于 0.1 - 0.5 之间)，超出线形范围的读数没有太大参考价值的。另外有两个有趣的现象：在水中测定 A260/A280，比值将变低 0.3 左右；而在 10mM EDTA 中测定的比值比在 1mM EDTA 中测定的高 0.2 左右。这两点也是要注意的，所以当我们用DEPC处理过的水溶解RNA并测定其260/280比值的时候，往往都是小于2.0的。
此段来源于：http://blog.163.com/qcp_0451/blog/static/13604755520100254040361/
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2楼2011-08-10 22:52:06
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w2boluo

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+4): 很有经验啊！ 2011-08-10 23:19:16
西瓜(金币+2): 代楼主发 2011-08-13 00:28:27
你用的比色杯是多少微升的？这个很关键。
一般而言，我们用的紫外分光光度计的读数只有在OD值0.1到1之间才比较准，低于0.1或者高于1，都要打折扣。电泳图片好才是真的好。
我用过的杯子50ul的塑料杯，比较准，100ul的石英杯是不折不扣的杯具，读数任何时候都在乱跳。了解一下别人的OD值指标如何也行。
但多数时刻，我们提的RNA由于体积不够，都必须稀释，稀释后的吸光度必须落在0.1到1之间。如果电泳图片好，我选择无视吸光度，直接反转录。
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How about the future？
3楼2011-08-10 22:53:15
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gwbk

木虫 (正式写手)
★
西瓜(金币+1): 你牛。。。 2011-08-13 00:42:26
老板问说，提的质粒电泳验证了吗？直接做酶切？起码看看质粒有几条带。。。答曰：实验紧，这些都做费时间，那个XXXX的质粒提取试剂盒很好用的，每次都验证出来，麻烦。这次省了（其实不知道省了多少次呢）。哈哈~~~~

不过做实验还是严谨点好啊~特别是一些很容易失败的实验，嘿嘿
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5楼2011-08-11 00:03:14
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