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一小段文献中方法的问题？？？有点没看明白
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本人新手，在一篇文献上学习一个蛋白的纯化步骤，这个蛋白用的是TEV-HIS TAG , 而且还有GST标签，我不大明白，为什么这么繁琐，只用HIS或者GST不行么？一下是这段的原文 The supernatant was loaded onto a glutathione sepharose column (GE Healthcare). After extensive washing with 20mM Tris buffer pH 8.0, 500mM NaCl, 1mM DTT, the GSTmoiety was cleaved by His-tagged TEV protease in the same wash buffer at 4°C overnight. The protein was passed through a Ni2+- NTA agarose column (Qiagen) to eliminate the His-tagged TEV protease, |
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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
silicare(金币+5, BioEPI+1): 2011-08-10 12:05:50
loveskyzhou(金币+2): 谢谢 2011-08-10 12:55:27
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
silicare(金币+5, BioEPI+1): 2011-08-10 12:05:50
loveskyzhou(金币+2): 谢谢 2011-08-10 12:55:27
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直译一下： 分装上清至谷胱甘肽收集柱(GE Healthcare)，用20mM Tris buffer pH 8.0, 500mM NaCl, 1mM DTT充分洗涤后，再用相同的buffer4℃浸泡过夜，部分GST被His-tagged TEV 蛋白酶剪切。随后该蛋白通过Ni2+- NTA 琼脂糖分离柱（Qiagen）去除His-tagged TEV 蛋白酶。 |
2楼2011-08-09 20:58:15
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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
adslye(金币+5): 解释地很清楚了，感谢交流！ 2011-08-29 09:53:30
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
adslye(金币+5): 解释地很清楚了，感谢交流！ 2011-08-29 09:53:30
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简单的说，（目的蛋白-GST）首先结合于glutathione sepharose column，然后通过加入His-tagged TEV protease （蛋白酶）切断目的蛋白和GST之间的连接肽，再加入buffer就可以把目的蛋白洗脱下来，柱子上则剩余结合的GST。 洗脱出的目的蛋白里面还有His-tagged TEV protease杂质，这部分通过Ni柱和His-tagged TEV protease特异性结合而去掉，最后溶液中就只有目的蛋白了。 这个方法是目前用的比较多的一种纯化方法，但通过这些亲和吸附之类的办法纯化蛋白质，最后都必须将诸如Histag、GST和CBD之类的标记tag去掉。蛋白酶方法是实验室里常用的一种。另外也有包括化学法（例如羟胺和溴化氢）、内含肽（intein）之类的等等其他手段。 |
3楼2011-08-10 15:27:51