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weekends

木虫 (小有名气)

[求助] 引物的片段怎么算？急！！！

实验中遇到的困难，我通过常规的方法blast不出来，提示“Please correct the following errors: Specified left primer exceeds built-in maximum of 36.”不知什么原因，请高手指点，或者帮我弄一下，最好的教我如何做，让小生学习学习！非常感谢啦！
目的基因        引物序列       
sh1上游：        GATCCGGATTGTCATGTGACTATAAATTCAAGAGATTTATAGTCACATGACAATCCTTTTTTA       
sh1下游：        AGCTTAAAAAAGGATTGTCATGTGACTATAAATCTCTTGAATTTATAGTCACATGACAATCCG       
预计片段大小（bp）？

sh2上游：GAT CCC GAC AGT GCA AAT ACG ACA AAT TCA AGA GAT TTG TCG TAT TTG CAC TGT CGT TTT TTA       
sh2下游：AGC TTA AAA AAC GAC AGT GCA AAT ACG ACA AAT CTC TTG AAT TTG TCG TAT TTG CAC TGT CGG       
预计片段大小（bp）？

sh3上游：GAT CCG ATC CGA CGT CTA CAG CTA TAT TCA AGA GAT ATA GCT GTA GAC GTC GGA TCT TTT TTA       
sh3下游：AGC TTA AAA AAG ATC CGA CGT CTA CAG CTA TAT CTC TTG AAT ATA GCT GTA GAC GTC GGA TCG       
预计片段大小（bp）？

shNC上游：GAT CCT TCT CCG AAC GTG TCA CGT TCT TCA AGA GAG AAC GTG ACA CGT TCG GAG AAT TTT TTA       
shNC下游：AGC TTA AAA AAT TCT CCG AAC GTG TCA CGT TCT CTC TTG AAG AAC GTG ACA CGT TCG GAG A AG       
预计片段大小（bp）？
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1楼 2011-07-18 20:23:34
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gwbk

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
dhd997(金币+3): 2011-07-19 08:00:59
抛砖引玉
Specified left primer exceeds built-in maximum of 36
这句话大概是说，指定的引物超出了内置的36个碱基最大值。

你是用软件Blast吗？修改一下“内置36碱基最大值”参数，或者将引物变短试试。
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2楼2011-07-18 21:21:59
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weekends

木虫 (小有名气)
“修改一下“内置36碱基最大值”参数，或者将引物变短试试”
怎么弄还是不会！高手能帮帮我吗？
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3楼2011-07-18 21:34:31
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
Originally posted by weekends at 2011-07-18 20:23:34:
实验中遇到的困难，我通过常规的方法blast不出来，提示“Please correct the following errors: Specified left primer exceeds built-in maximum of 36.”不知什么原因，请高手指点，或者帮我弄一下，最好的教我 ...

四个预计片段大小都是67bp。
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4楼2011-07-18 21:47:50
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gwbk

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by lxj341401 at 2011-07-18 21:47:50:
四个预计片段大小都是67bp。

愿闻其详~
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5楼2011-07-18 22:50:28
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weekends

木虫 (小有名气)
四个预计片段大小都是67bp。 ？？？？？
不懂怎么出来的！
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6楼2011-07-18 23:10:03
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
dhd997(金币+3, EPI+1): 2011-07-19 08:01:15
weekends(金币+5): 谢谢!有点道理！ 2011-07-20 23:16:43
引用回帖:
Originally posted by lxj341401 at 2011-07-18 21:47:50:
四个预计片段大小都是67bp。

因为DNA两条链的走向相反，所以下游引物先反向互补，然和和上游引物比对，重叠的都是59个碱基，每条引物各有4个碱基不互补，所以预计片段大小4+59+4=67.
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7楼2011-07-19 07:41:10
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
但是没搞明白楼主的引物为什么都这么长（63个碱基）!
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8楼2011-07-19 07:43:08
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
引用回帖:
Originally posted by lxj341401 at 2011-07-19 07:43:08:
但是没搞明白楼主的引物为什么都这么长（63个碱基）!

莫非是Overlap PCR？
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9楼2011-07-19 16:30:13
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gwbk

木虫 (正式写手)
★
西瓜(金币+1): 等楼主解答吧 2011-07-21 11:02:10
有点像OverLap的引物....但Overlap也没必要这么长吧，片段连接或者单位点突变40个够了吧？莫非是多位点突变Overlap？
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10楼2011-07-19 21:45:47
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