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yuliansheng

金虫 (小有名气)

[求助] 关于限制性内切酶的失活

今天做实验，突然被一个问题蒙住了。学得不好，请高手们赐教。
在基因重组过程中，进行限制性内切酶酶切后，要对限制性内切酶的失活，每个酶都有自己对应的失活温度，我所用的酶组的失活温度是100°。这样的温度一下使我想起PCR的解链温度，大概也就在90多度。那试问一下，这样高的失活温度，不会导致基因双链分离吗？
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学习....
1楼 2011-07-01 17:16:41
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷

【答案】应助回帖

★
dhd997(金币+1): 2011-07-01 19:29:53
没必要那么高吧，一般最高也就80℃了。
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Thank-you，so-blue.
2楼2011-07-01 17:21:27
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yuliansheng

金虫 (小有名气)
★ ★
dhd997(金币+2): 2011-07-01 19:30:06
引用回帖:
Originally posted by susizheng at 2011-07-01 17:21:27:
没必要那么高吧，一般最高也就80℃了。

我用的是TOYOBO东洋纺公司生产的限制性内切酶，每个酶都有自己严格的失活温度，所以必须按要求。比如，我用的是限制性内切酶SphⅠ和BglⅡ，这两个酶的失活温度全都是100° 5分钟。
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学习....
3楼2011-07-01 18:26:35
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
★
dhd997(金币+1): 2011-07-01 19:30:11
即使高温基因双链分离后降温会重新成双链的。
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4楼2011-07-01 18:36:11
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
专家vs专家，我只围观，不说话。。。。
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
5楼2011-07-01 20:21:24
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献

【答案】应助回帖

4楼正解，要不PCR咋做。。。。PCR第二步不就是退火么。。。。

脑袋学傻了
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The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
6楼2011-07-01 22:37:46
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chasetju

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
西瓜(金币+2): 鼓励应助 2011-07-02 15:41:49
引用回帖:
Originally posted by yuliansheng at 2011-07-01 17:16:41:
今天做实验，突然被一个问题蒙住了。学得不好，请高手们赐教。
在基因重组过程中，进行限制性内切酶酶切后，要对限制性内切酶的失活，每个酶都有自己对应的失活温度，我所用的酶组的失活温度是100°。这样的温度 ...

没有关系，热失活以后，慢慢降温，使变性为单链的DNA复性，他们又重新变回双链了。这个时候不要疾冷就行。
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7楼2011-07-02 07:57:48
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cdl007

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, EPI+1): 学习了！ 2011-07-02 15:42:18
yuliansheng(金币+1): 2011-07-15 08:49:06
整点SDS就失活了

酶一般都配有loadingbuffer，里面含sds，酶切玩直接电泳回收，可以省掉灭活的步骤
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8楼2011-07-02 10:42:23
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shusheng2006

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

嗯。楼上说得对。如果要进行第二步酶切也可以选择用酚氯仿简单抽提下～
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9楼2011-07-03 17:45:59
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kalsy

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by chasetju at 2011-07-02 07:57:48
没有关系，热失活以后，慢慢降温，使变性为单链的DNA复性，他们又重新变回双链了。这个时候不要疾冷就行。...

请问，一个温度是65，一个是80，按照温度低的来灭活吗？谢谢。
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10楼2013-09-13 16:43:59
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