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uulove37金虫 (著名写手)
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[求助]
微生物降解纤维素的纤维素酶活如何测？
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| 求助：纤维素降解过程中的的纤维素酶活怎么测啊？最好有具体的步骤，各种药品的用量也都越清楚越好！谢谢 |
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yhjcwangyw
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【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
uulove37(金币+5): 2011-06-30 20:39:06
wolfebst(金币+5, EPI+1): 鼓励 2011-06-30 22:00:53
uulove37(金币+5): 2011-06-30 20:39:06
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我当时的测定方法 主要试剂配制方法 1．硝基水杨酸（DNS）试剂[91]: 称取酒石酸钾钠91g，溶于500ml蒸馏水中，加热至50℃溶解，再依次加入3，5-二硝基水杨酸(DNS)3.5g，NaOH20g，苯酚2.5g，无水亚硫酸钠2.5g，搅拌至完全溶解。冷却后用蒸馏水定容至1000ml，储于棕色瓶中4℃保存，放置1周左右后使用，使用前过滤。 2．1mg/lml标准葡萄糖溶液：精确称取105℃烘至恒重的无水葡萄糖(分析纯)1.000g，用蒸馏水溶解后，定容至1000ml容量瓶中备用。 3．1%CMC底物溶液：1克CMC加热溶化于100m1pH值4.8，0.lmol/L的柠檬酸一檬酸钠缓冲液中。 4．pH值4.8，0.lmol/L的柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液: 0.lmol/L柠檬酸：含柠檬酸•H2O21.01g/L。 0.lmol/L的柠檬酸三钠：含柠檬酸三钠•2H2O 29.4g/L。 0.lmol/L的柠檬酸40ml与0.lmol/L的柠檬酸三钠60.6ml混合即可。 5. KH2PO4-Na2HPO缓冲液（pH7.0） 取 4.539 克 KH2PO4 和 11.939 克 Na2HPO4•12H2O，溶解于蒸馏水中，定容至1000mL，用 0.5mol/L KH2PO4 或 0.5mol/L Na2HPO4 调至 pH7.0。 3，5-二硝基水杨酸（DNS）法测定还原糖 测定原理 纤维素经纤维素酶水解后生成还原糖，还原糖能将3，5—二硝基水杨酸（DNS）中硝基还原成氨基，溶液变为橙色的氨基化合物（:3—氨基—5—二硝基水杨酸)，在一定的还原糖浓度范围内，橙色的深度与还原糖的浓度成正比，从而可推算出溶液中还原糖的含量。 葡萄糖标准曲线绘制 取七只25ml的比色管，分别编号，然后按下表加入试剂后，540nm测定吸光值，绘制葡萄糖标准曲线。 葡萄糖标准曲线绘制 Table2-3 Glucose standard curve drawing 项目 管号 0 1 2 3 4 5 6 葡萄糖标样（ml） 0 1.5 2 2.5 3 3.25 3.5 含糖总量（mg） 0 1.5 2 2.5 3 3.25 3.5 DNS（ml） 3 3 3 3 3 3 3 加水至10ml刻度线 沸水煮沸10min，使其充分反应后，流水快速冷却 定容 25 25 25 25 25 25 25 纤维素酶酶活测定 1 滤纸酶活测定 以滤纸为底物，在一定反应条件(pH4.8，50℃，恒温lh)下，以水解反应中lml纤维素酶液lmin催化纤维素生成lµg葡萄糖为1个滤纸酶活单位，以U表示，该酶活力代表了纤维素酶的三种酶组分协同作用后的总酶活。测定方法为：取1ml适当稀释的酶液，加入pH值为4.8，0.lmol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液2ml，再加入50土0.5mg滤纸(1cmx6cm)一条，于50℃保温酶解反应1小时 (先预热5分钟)，然后加入DNS显色液3ml，放入已沸腾的水中沸水浴10min，流水冷却后在540nm下测吸光度。同时用100℃煮沸10min后失活的酶液作为空白对照。根据吸光度从葡萄糖标准曲线中查出相应的葡萄糖含量，根据生成的葡萄糖克数计算出酶活值。滤纸酶活按下面公式计算:：X=(WxNxMx1000)/T X：滤纸酶酶活力，单位U/ml；W：从葡萄糖标准曲线中查得的葡萄糖的浓度(mg/ml)。 M：反应后样品总体积(ml)；N：酶液稀释倍数；T:反应时间(min)。 2 CMC酶活测定 以1%CMC溶液为底物，在一定反应条件(pH4.8，50℃，恒温30min)下，以水解反应中，lml纤素酶液lmin催化纤维素生成lµg葡萄糖为1个CMC酶活单位，以U表示。该酶活代表了纤维素酶内切葡聚糖酶活力。测定方法为：取1ml适当稀释的酶液，加入1%CMC底物溶液2ml，50℃保温酶解反应30min(先预热5分钟然)后加入DNS显色液3ml，放入已沸腾的水中沸水浴10min，流水冷却后在540nm下测吸光度。同时用100℃煮沸10min后失活的酶作为空白对照。根据吸光度从葡萄糖标曲线中查出相应的葡萄糖含量，根据生成的葡萄糖克数计算出CMC酶活值。 |
siwonyy
2楼2011-06-30 09:39:24
mengxibio
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【答案】应助回帖
★ ★ ★
uulove37(金币+5): 2011-06-30 20:45:57
wolfebst(金币+3): 鼓励 2011-06-30 22:01:23
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wolfebst(金币+3): 鼓励 2011-06-30 22:01:23
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筛选用刚果红，测酶活用DNS法。 具体方法参见： http://wenku.baidu.com/view/6fb4b852ad02de80d5d84005.html 话说纤维素酶是我本科时某几个实验室做的课题，lz是哪个学校的啊 |
3楼2011-06-30 11:10:01
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