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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 微生物降解纤维素的纤维素酶活如何测？
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uulove37

金虫 (著名写手)

[求助] 微生物降解纤维素的纤维素酶活如何测？

求助：纤维素降解过程中的的纤维素酶活怎么测啊？最好有具体的步骤，各种药品的用量也都越清楚越好！谢谢
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1楼2011-06-30 09:15:11
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yhjcwangyw

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
uulove37(金币+5): 2011-06-30 20:39:06
wolfebst(金币+5, EPI+1): 鼓励 2011-06-30 22:00:53
我当时的测定方法
主要试剂配制方法
1．硝基水杨酸（DNS）试剂[91]: 称取酒石酸钾钠91g，溶于500ml蒸馏水中，加热至50℃溶解，再依次加入3，5-二硝基水杨酸(DNS)3.5g，NaOH20g，苯酚2.5g，无水亚硫酸钠2.5g，搅拌至完全溶解。冷却后用蒸馏水定容至1000ml，储于棕色瓶中4℃保存，放置1周左右后使用，使用前过滤。
2．1mg/lml标准葡萄糖溶液：精确称取105℃烘至恒重的无水葡萄糖(分析纯)1.000g，用蒸馏水溶解后，定容至1000ml容量瓶中备用。
3．1%CMC底物溶液：1克CMC加热溶化于100m1pH值4.8，0.lmol/L的柠檬酸一檬酸钠缓冲液中。
4．pH值4.8，0.lmol/L的柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液:
0.lmol/L柠檬酸：含柠檬酸•H2O21.01g/L。
0.lmol/L的柠檬酸三钠：含柠檬酸三钠•2H2O 29.4g/L。
0.lmol/L的柠檬酸40ml与0.lmol/L的柠檬酸三钠60.6ml混合即可。
5. KH2PO4-Na2HPO缓冲液（pH7.0）
取 4.539 克 KH2PO4 和 11.939 克 Na2HPO4•12H2O，溶解于蒸馏水中，定容至1000mL，用 0.5mol/L KH2PO4 或 0.5mol/L Na2HPO4 调至 pH7.0。

3，5-二硝基水杨酸（DNS）法测定还原糖
测定原理
纤维素经纤维素酶水解后生成还原糖，还原糖能将3，5—二硝基水杨酸（DNS）中硝基还原成氨基，溶液变为橙色的氨基化合物（:3—氨基—5—二硝基水杨酸)，在一定的还原糖浓度范围内，橙色的深度与还原糖的浓度成正比，从而可推算出溶液中还原糖的含量。
葡萄糖标准曲线绘制
取七只25ml的比色管，分别编号，然后按下表加入试剂后，540nm测定吸光值，绘制葡萄糖标准曲线。
       葡萄糖标准曲线绘制
Table2-3 Glucose standard curve drawing
项目    管号        0        1        2        3        4        5        6
葡萄糖标样（ml）        0        1.5        2        2.5        3        3.25        3.5
含糖总量（mg）        0        1.5        2        2.5        3        3.25        3.5
DNS（ml）        3        3        3        3        3        3        3
加水至10ml刻度线
沸水煮沸10min，使其充分反应后，流水快速冷却
定容        25        25        25        25        25        25        25
纤维素酶酶活测定
1 滤纸酶活测定
以滤纸为底物，在一定反应条件(pH4.8，50℃，恒温lh)下，以水解反应中lml纤维素酶液lmin催化纤维素生成lµg葡萄糖为1个滤纸酶活单位，以U表示，该酶活力代表了纤维素酶的三种酶组分协同作用后的总酶活。测定方法为：取1ml适当稀释的酶液，加入pH值为4.8，0.lmol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液2ml，再加入50土0.5mg滤纸(1cmx6cm)一条，于50℃保温酶解反应1小时 (先预热5分钟)，然后加入DNS显色液3ml，放入已沸腾的水中沸水浴10min，流水冷却后在540nm下测吸光度。同时用100℃煮沸10min后失活的酶液作为空白对照。根据吸光度从葡萄糖标准曲线中查出相应的葡萄糖含量，根据生成的葡萄糖克数计算出酶活值。滤纸酶活按下面公式计算:：X=(WxNxMx1000)/T
X：滤纸酶酶活力，单位U/ml；W：从葡萄糖标准曲线中查得的葡萄糖的浓度(mg/ml)。
M：反应后样品总体积(ml)；N：酶液稀释倍数；T:反应时间(min)。
2 CMC酶活测定
以1%CMC溶液为底物，在一定反应条件(pH4.8，50℃，恒温30min)下，以水解反应中，lml纤素酶液lmin催化纤维素生成lµg葡萄糖为1个CMC酶活单位，以U表示。该酶活代表了纤维素酶内切葡聚糖酶活力。测定方法为：取1ml适当稀释的酶液，加入1%CMC底物溶液2ml，50℃保温酶解反应30min(先预热5分钟然)后加入DNS显色液3ml，放入已沸腾的水中沸水浴10min，流水冷却后在540nm下测吸光度。同时用100℃煮沸10min后失活的酶作为空白对照。根据吸光度从葡萄糖标曲线中查出相应的葡萄糖含量，根据生成的葡萄糖克数计算出CMC酶活值。
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siwonyy
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2楼2011-06-30 09:39:24
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mengxibio

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
uulove37(金币+5): 2011-06-30 20:45:57
wolfebst(金币+3): 鼓励 2011-06-30 22:01:23
筛选用刚果红，测酶活用DNS法。
具体方法参见：
http://wenku.baidu.com/view/6fb4b852ad02de80d5d84005.html

话说纤维素酶是我本科时某几个实验室做的课题，lz是哪个学校的啊
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3楼2011-06-30 11:10:01
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uulove37

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by mengxibio at 2011-06-30 11:10:01:
筛选用刚果红，测酶活用DNS法。
具体方法参见：
http://wenku.baidu.com/view/6fb4b852ad02de80d5d84005.html

话说纤维素酶是我本科时某几个实验室做的课题，lz是哪个学校的啊

纤维素酶活永远都不会衰败啊！你们测纤维素酶活是干什么用啊
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4楼2011-06-30 20:46:41
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mengxibio

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by uulove37 at 2011-06-30 20:46:41:
纤维素酶活永远都不会衰败啊！你们测纤维素酶活是干什么用啊

当时本科时，微生物系有个大方向就是研究纤维素酶。降解秸秆，这样能产生葡萄糖，供发酵工程上使用，所以好几个实验室在做这块。还有研究漆酶的，还有个动物学的老师从白蚁肠道中筛纤维素酶。
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5楼2011-06-30 22:28:03
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uulove37

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by mengxibio at 2011-06-30 22:28:03:
当时本科时，微生物系有个大方向就是研究纤维素酶。降解秸秆，这样能产生葡萄糖，供发酵工程上使用，所以好几个实验室在做这块。还有研究漆酶的，还有个动物学的老师从白蚁肠道中筛纤维素酶。

你们做得还很系统啊，那白蚁肠道中筛出来了吗？
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6楼2011-07-01 09:23:54
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jingxin1897

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
rainwander(金币+2): 鼓励交流 2011-07-03 16:56:10
uulove37(金币+5): 2011-07-04 13:51:54
楼主是否听说过利用酶标仪测纤维素酶活，根据荧光强度变化，求得单位酶活。我曾经用这样的方法测过土壤胞外酶活，还是挺方便的，具体的方法建议楼主参考国外一些实验室的方案。
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7楼2011-07-03 01:17:19
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uulove37

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by jingxin1897 at 2011-07-03 01:17:19:
楼主是否听说过利用酶标仪测纤维素酶活，根据荧光强度变化，求得单位酶活。我曾经用这样的方法测过土壤胞外酶活，还是挺方便的，具体的方法建议楼主参考国外一些实验室的方案。

这个还真没试过，非常感谢，我试试
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8楼2011-07-04 13:52:27
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xiamingliu

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

uulove37(金币+1): 2011-07-08 10:14:05
这个用dns法
我想请问各位高人 葡糖酸内酯酶的活性如何测  请各位予以指点和帮助
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9楼2011-07-05 13:27:07
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uulove37

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by xiamingliu at 2011-07-05 13:27:07:
这个用dns法
我想请问各位高人 葡糖酸内酯酶的活性如何测  请各位予以指点和帮助

俺不知道啊
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10楼2011-07-06 11:56:27
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