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求助：关于基因表达中调控蛋白和转录调控蛋白的连接和表达
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已知条件：目前通过异源表达了一段基因A，得到蛋白活性，这段基因A的原始来源的下游有两个反向ORF，分别执行了调控和转录调控的功能，现已证明了这两个ORF的存在对A的活性有明显的提高作用，所以想吧这两个反向ORF 也异源表达来看看是否在异源宿主里对A亦有促进作用。 问题： （1）这两个反向ORF 和A是同基因簇来源，紧密相连，而且二者有重叠区域，那么我在做异源表达的时候是直接把这两个反向ORF 一次性的扩增出来表达呢？还是应该分别扩增，然后连接起来再去表达？ （2）和A同基因簇来源的这两个ORF 同A的转录翻译反向相反，那么在异源表达是否应该也是反向表达，还是应该调整顺序后在进行表达？ （3）A基因和它下游的两个ORF 是同基因簇来源的，那么，是否意味着A的上游一些比如启动原件对于两个反向的ORF 也有作用，还是这两个反向的ORF 的下游也有某些启动原件，那么这些启动原件如何进行分析？在做异源表达的时候是否也应该加上去？ 愿意和坛子你的各位进行广泛交流！ |
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 【分子生物】EPI帖 |
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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楼主，你好！我现在也遇到了跟你同样的问题，特向你求助！ 非常期待能得到你的回复！ 已知条件：现已知某原核生物中基因组上有三个基因A,B和C参与合成某种酶（其中B和C预测是分子伴侣蛋白，对A合成的蛋白进行加工）。现在我想在原核生物中异源表达这三个蛋白，但是它们在原始来源的基因组上，A和B方向相同，而C与A,B方向相反。且B和C之间序列之间有重叠区域。那么我在做异源表达的时候是直接把这三个基因一次性的扩增出来去表达呢？还是应该分别扩增，然后连接起来再去表达？ （1）如果是把这三个基因一次性的扩增出来去表达，我就打算在A基因上游加一个启动子，那这个启动子对C有作用吗（因为基因C与A的方向是相反的）？或者能不能在A基因上游加一个启动子的同时，在C的下游加一个反向的启动子（此时C基因及其启动子反向互补区是同方向的）？ （2）如果把三个基因分别扩增，是不是会破坏B和C基因重叠区域可能存在的某种调控作用？ 非常期待你的回复！十分感谢！ |
6楼2013-05-28 21:51:08
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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
西瓜(金币+5, EPI+1): Good! 2011-06-09 23:46:50
ottolzm(金币+3): 2011-06-10 11:51:44
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
西瓜(金币+5, EPI+1): Good! 2011-06-09 23:46:50
ottolzm(金币+3): 2011-06-10 11:51:44
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已知条件：目前通过异源表达了一段基因A，得到蛋白活性，这段基因A的原始来源的下游有两个反向ORF，分别执行了调控和转录调控的功能，现已证明了这两个ORF的存在对A的活性有明显的提高作用，所以想吧这两个反向ORF 也异源表达来看看是否在异源宿主里对A亦有促进作用。 问题： （1）这两个反向ORF 和A是同基因簇来源，紧密相连，而且二者有重叠区域，那么我在做异源表达的时候是直接把这两个反向ORF 一次性的扩增出来表达呢？还是应该分别扩增，然后连接起来再去表达？ ++++++++++++++++++++一这两个反向ORF位于下游,且执行转录调控功能,那么有两种可能,一个是反向ORF表达出的蛋白结合在A上游序列，起到转录调控作用，那么你可能要在A基因上游找找有没有这样的结合位点，可以通过生物信息学方法预测，如果有，那么这个调控区也得一块扩增到异源宿主里，另外一个是这两个反向ORF有助于A基因MRNA的稳定，或者说是有助于核糖体和A基因的结合，那么这个情况，一起扩增ABC这三个就可以了，启动子用宿主的。 （2）和A同基因簇来源的这两个ORF 同A的转录翻译反向相反，那么在异源表达是否应该也是反向表达，还是应该调整顺序后在进行表达？ ++++++++++++++++++++++++++++++这个方向更本不用调整，当然，你可以尝试调整后，做做这个实验 （3）A基因和它下游的两个ORF 是同基因簇来源的，那么，是否意味着A的上游一些比如启动原件对于两个反向的ORF 也有作用， +++++++++++++++++这个有可能，但是你可以用在以远宿主菌表达ABC，在以远宿主菌表达BC比较两种情况BC的活性，来初步解决这个问题，当然，正如第一个问题所说，在A的上游也可能存在BC的调控位点 还是这两个反向的ORF 的下游也有某些启动原件，那么这些启动原件如何进行分析？在做异源表达的时候是否也应该加上去？ +++++++++++++++某基因下游一般很少有该基因的启动元件，下游调控比较复杂，一般不用考虑这一步。 因为楼主给的信息，可以解释的很多，只能给出个大概我的看法，希望大家指正。 [ Last edited by 啮风 on 2011-6-9 at 23:10 ] |
2楼2011-06-09 23:07:22
3楼2011-06-09 23:44:53
4楼2011-06-10 11:55:14
